[发明专利]检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法

说明书

一种检测蛋白电荷变异体的方法。该方法包括，通过pH‑IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。利用根据本发明实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pI值(isoelectric point)为5.5～8.0的重组DNA的蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法。

背景技术

目前，人用重组DNA蛋白制品或人用重组单克隆抗体制品大多是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，在产品的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解及各种翻译后修饰，从而导致产品的分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生。这些变体的形成可能发生在产品的整个生命周期内的任何阶段，有资料显示，仅翻译后修饰(如N-末端谷氨酸环化、C-末端赖氨酸截除、N-末端谷氨酰胺/谷氨酸环化、脱酰胺、氧化、唾液酸修饰等)的异质性即可达2.85×10⁸。几乎所有这些翻译后修饰均可改变单抗的表面电荷分布特性，而电荷异质性对单抗的稳定性及其生物学功能发挥具有重要的影响而成为关键质量属性(CQA)，并且电荷异质性可反映其生产工艺的稳定性，所以受到生物技术产业界及监管机构密切关注。

人用药物注册技术要求国际协调会ICH出台的指导原则中Q6B部分根据单抗变体对产品安全性、有效性的影响程度，将其分为产品相关物质及产品相关杂质，对产品相关物质及产品相关杂质的鉴别、质量研究及质量控制具有重要意义。在生产过程中，尤其是在生产工艺改变后，还需进一步监测电荷变体的形成原因及其对产品安全性、有效性的影响。通过改变工艺条件、制剂方法等方式来减少电荷变体，并对抗体的电荷变体进行评估，以确定是否需要作为放行标准以及将其作为产品一致性的参考标准。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速、准确、灵敏地检测蛋白电荷变异体的方法。

需要说明的是，本申请所述的蛋白电荷变异体是指蛋白翻译后修饰(如唾液酸化)致使蛋白电荷量发生改变而形成的异构体。

另外，需要说明的是，pH-IEC离子交换色谱法(pH Gradient Ion ExchangeChromatography，pH梯度离子交换色谱法)的具体分离原理是，pH梯度可以改变检测物质电荷、偏离等电点的程度,从而影响带正/负电荷的分子或离子与色谱柱固定相的结合能力,洗脱时的难易程度发生改变,从而改变了分离的选择性，最终实现各组分分离。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测蛋白电荷变异体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括，通过pH-IEC离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。利用根据本发明实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pI值为5.5～8.0的重组DNA的蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。

根据本发明的实施例，所述检测蛋白电荷变异体的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述pH-IEC离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、Tris和水的混合溶液，其中，所述哌嗪、咪唑和Tris的质量比为2:0.4:1.2。发明人在实验中发现，采用哌嗪、咪唑和Tris的质量比为2:0.4:1.2的混合溶液作为流动相，各变异体峰基本与主峰实现分离。

根据本发明的实施例，所述哌嗪的浓度为2g/L，所述咪唑的浓度为0.4g/L，所述Tris的浓度为1.2g/L。发明人在实验中发现，采用前述哌嗪、咪唑和Tris的浓度，变异体峰与主峰分离度好且峰形尖锐对称，可实现对蛋白变异体的准确定量。