[发明专利]用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法

权利要求书

1.一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法，其特征在于：首先，利用酵母将N¹⁵无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N¹⁵的蛋白，再将酵母磨碎，释放菌体所含蛋白质，经提取纯化制成含N¹⁵的菌体蛋白粉末，同时利用N¹⁵无机盐培养螺旋藻，当螺旋藻培养代数达到6代以上，藻体中所含N元素98％以上都为N¹⁵，再将螺旋藻收获、干燥后得到含N¹⁵的螺旋藻干粉，利用含N¹⁵的菌体蛋白粉末和含N¹⁵的螺旋藻干粉取代常规的N¹⁴原料制作成鼠粮，为实验鼠蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N¹⁵同位素标记，其具体包括以下步骤：

1)按照以下配方配制只含N¹⁵的酵母菌无机培养基：

在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：

使用高压灭菌锅，将步骤1)中的培养基在120摄氏度下灭菌20分钟；

2)按照以下配方配制只含N¹⁵的螺旋藻无机培养基：

在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：

使用高压灭菌锅，将步骤2)中的培养基在120摄氏度下灭菌20分钟；

3)待步骤1)和2)中的培养基冷却至室温后，挑取单菌落酵母菌接种在酵母菌无机培养基中培养；选取所需藻种，接种在螺旋藻无机培养基中，调节温度和光照，通入空气并放在匀速振荡器上培养，达到均匀的效果；

4)待酵母菌培养代数达到6代以上，取出培养基并离心，用灭菌后的生理盐水清洗，得到酵母菌体；

6)收集到的菌体称重后，与氯化钠溶液以1:1～1.5的比例混合成新的菌液，放置于50～60℃环境下，定时震荡，令酵母菌自溶释放蛋白质；

7)自溶后，用巴氏灭菌法令菌液中的酶失活，离心后收集液体；

8)将步骤7)中的液体冷冻干燥后，得到含N¹⁵的菌体蛋白粉末；

9)待螺旋藻培养代数达到6代以上，取出培养基并过滤，收集藻体；

10)用无菌水反复冲刷清洗藻体降低盐分，清洗后的藻体均匀平铺在广口敞开的容器中，放入冰箱冷冻；

11)将预冻好的螺旋藻放入热风干燥箱中干燥，得到含N¹⁵的螺旋藻干粉；

12)N¹⁵实验鼠饲料的配制：将步骤8)中制成的菌体蛋白粉末和步骤11)中制成的螺旋藻干粉作为饲料的基本氮源和主要碳源，取代常规的N¹⁴原料用于培养，再加入不含N元素的其他原料，制成最终的N¹⁵实验鼠饲料。

2.根据权利要求1所述的一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤3)中，酵母将培养基中的N¹⁵无机盐转化成生物蛋白，螺旋藻将培养基中的N¹⁵无机盐转化为生物蛋白和其它含N物质，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N¹⁵的蛋白；当螺旋藻培养代数达到6代以上，藻体中所含N元素98％以上都为N¹⁵，而实际操作中根据最终配制的实验鼠饲料选择不同的酵母菌、螺旋藻和只含N¹⁵的无机培养基配方。

3.根据权利要求1所述的一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤12)中，能够依据情况配制N¹⁵实验小鼠饲料、N¹⁵实验大鼠饲料、N¹⁵实验豚鼠饲料，最终制备的饲料中N元素全部来源于步骤1)至步骤12)中经提取纯化后菌体蛋白粉末和螺旋藻干粉的N¹⁵，为实验鼠蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N¹⁵同位素标记，而无机盐和饲料的具体制作条件要根据实验鼠的生长特征而定。