[发明专利]用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质稳定同位素标记定量的技术领域，尤其是指一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法。

背景技术

生物样本或生物体的蛋白质定量分析是研究蛋白质功能机理和探索蛋白质群体内的相互关系和作用模式的重要方法，同时也为寻求疾病蛋白标记物和药物靶标带来了新的思维方式和研究方向。近年来，随着质谱技术和生物信息学的进步，稳定同位素标记技术已成为定量蛋白质组学中基础又常用的方法。目前生物样本蛋白质定量技术主要有同位素代谢标记法的SILAC技术。

SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)是哺乳动物细胞稳定同位素代谢标记技术，其基本原理是采重型外源稳定同位素氨基酸(主要有Lys和Arg)加入培养基培养细胞，细胞在新合成的蛋白质中嵌合了同位素氨基酸，经过培养5-6代后(2⁶)，细胞的所有蛋白质基本98％以上的蛋白质被同位素标记。不同条件处理的蛋白样品等量混合，之后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，可得到蛋白的定量结果。

但体外培养的细胞很难复制生物机体的复杂内环境，不能完整地反映生物生长发育和疾病过程中的蛋白质功能调控和生理变化，因此，动物体的蛋白质稳定同位素标记技术的发展极为重要。

实验鼠类作为最常用的实验动物，它的生理过程和生长发育过程都与人类十分相似，可真实模拟人类的生理生化变化过程。国际上使用的SILAC实验鼠，标记培育方法多为使用轻、重稳定同位素标记氨基酸并制成鼠粮，用SILAC鼠粮饲养雌雄实验鼠至成熟期后交配受孕，持续用SILAC鼠粮喂养受孕实验鼠至生产仔鼠。经两代培养后，能得到完全标记的实验鼠。

SILAC鼠粮有明显的局限性，其情况如下：

1、操作繁琐。SILAC鼠粮制备流程包括：同位素标记氨基酸→合成标记蛋白质→免疫沉淀→电泳分离→干燥→制备鼠粮，操作复杂，使用细胞培养合成标记蛋白质效率低，不方便实施。

2、生产成本高。SILAC试剂价格昂贵，使用SILAC技术标记蛋白质并制成鼠粮，从而标记实验鼠，其中的试剂耗费巨大，培育几代实验鼠需求鼠粮多，成本十分高昂。

3、购买及运输困难。SILAC鼠粮是由国外公司生产，国内购买十分麻烦，且鼠粮易损坏或变质，难以经受长途运输。

螺旋藻是一种常用微藻类，具有蛋白质含量高，营养全面，易消化吸收且适口性好等特点，且安全性高，无毒副作用，是优秀的饲料原料。除此之外，螺旋藻的维生素含量也十分丰富，尤其以类胡萝卜素，B族维生素及维生素C等功能性维生素为主，能够满足实验鼠对维生素的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法，该方法可应用于实验鼠的蛋白质定量分析，操作简便，生产成本低，可大范围推广，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于实验鼠蛋白质定量和示踪的N¹⁵稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N¹⁵无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N¹⁵的蛋白，再将酵母磨碎，释放菌体所含蛋白质，经提取纯化制成含N¹⁵的菌体蛋白粉末。同时利用N¹⁵无机盐培养螺旋藻，当螺旋藻培养代数达到6代以上，藻体中所含N元素98％以上都为N¹⁵，再将螺旋藻收获、干燥后得到含N¹⁵的螺旋藻干粉。利用含N¹⁵的菌体蛋白粉末和含N¹⁵的螺旋藻干粉取代常规的N¹⁴原料制作成鼠粮，为实验鼠蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N¹⁵同位素标记。

实验鼠的基本营养需求包括糖类、蛋白质、脂类、维生素、无机盐和水分等。在本发明中，含N¹⁵的菌体蛋白粉末提供充足，氨基酸完整且高纯度的蛋白质源，含N¹⁵的螺旋藻干粉提供碳水化合物、优质蛋白质、维生素以及微量元素。

本发明所提供的方案步骤如下：

1)按照以下配方配制只含N¹⁵的酵母菌无机培养基：

在1升的蒸馏水中，包含以下按质量百分比计的组分：