[发明专利]一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法

权利要求书

1.一种亚马逊假丝酵母(Candida amazonensis)的FLP/FRT基因敲除方法，其特征在于，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒；

所述方法包括以下步骤：

(1)构建基因敲除盒，敲除盒从5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重组酶基因、SpCyC1t终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；

(2)用包含基因敲除盒的质粒转化Candida amazonensis，得到靶基因敲除的阳性克隆；

(3)将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述靶基因为PDC基因，编码丙酮酸脱羧酶，该基因编码序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的FRT位点的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的严格诱导型启动子SpGAL1p为Spathaspora passalidarum来源的β-半乳糖苷酶基因GAL1启动子，受半乳糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的严格诱导型启动子SpMAL1p为Spathaspora passalidarum来源的α-麦芽糖苷酶基因MAL1启动子，受麦芽糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的caFLP为适用于Candida amazonensis的重组酶基因，该基因的编码序列如SEQID NO:5所示；

所述的SpCyC1t终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的潮霉素抗性基因hphm表达盒，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述caFLP是指将酿酒酵母来源的FLP重组酶基因内含有的3个CTG密码子突变为TTG，使得在Candida amazonensis内编码的是亮氨酸，而非丝氨酸。