[发明专利]一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法

说明书

本发明公开了一个Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除系统，属于基因工程技术领域。本发明将FLP重组酶基因置于严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p下调控，并在FLP表达盒和抗性标记表达盒两端添加同向重复的FRT位点，以PDC为靶基因构建基因敲除盒整合到Candida amazonensis基因组中，后续通过添加诱导剂诱导FLP表达，实现抗性基因的切除。本发明首次实现了Candida amazonensis的无标记基因敲除，并可以用于连续敲除多个基因，为Candida amazonensis的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统。

背景技术

Candida amazonensis是近年来从亚马逊森林中新分离出的一株能够高效利用木糖的酵母，该酵母能够代谢多种糖类，同时具有发酵纤维二糖、海藻糖等的能力(CadeteRM,Melo MA,Lopes MR,Pereira GM,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,RosaCA.Candida amazonensis sp.nov.,an ascomycetous yeast isolated from rottingwood in the Amazonian forest.International journal of

systematic and evolutionary microbiology,2012,62(Pt 6):1438-1440.)。Cadete等(Cadete RM,Melo MA,Dussan KJ,Rodrigues RC,Silva SS,Zilli JE,Vital MJ,

Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Diversity and physiologicalcharacterization of D-xylose-fermenting yeasts isolated from the BrazilianAmazonian Forest.PLoS

ONE,2012,7(8):e43135.)在研究中发现Candida amazonensis具有快速代谢木糖的能力，并在木糖醇生产方面表现出一定优势。实验室前期研究注意到该酵母能够分别在高木糖浓度(350g/l)、高温42℃、pH 2.5等胁迫条件下仍能有效发酵木糖并积累较高的生物量，表现出良好的耐高糖、耐高温以及耐酸性能。有望成为新型木糖发酵模式菌株(范贺超,张梁,李赢,等.五株木糖利用酵母的生理代谢特性.微生物学报,2015,55(8):1026-1035.)

然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特性外，还需要基因表达与敲除等基本的分子生物学手段的有效支持，用以充分挖掘相关菌株优良信息。目前，Candidaamazonensis基因水平上的研究尚处于起步阶段，至今还未有全基因组测序的工作展开。此外，由于该酵母属于利用木糖类酵母，使用特殊的基因编码系统，即密码子CTG编码的是丝氨酸而非常见的亮氨酸(Wohlbach DJ,Kuo A,Sato TK,Potts KM,Salamov AA,LabuttiKM,Sun H,Clum A,Pangilinan JL,Lindquist EA,Lucas S,Lapidus A,Jin M,Gunawan C,Balan V,Dale BE,Jeffries TW,Zinkel R,Barry KW,Grigoriev IV,GaschAP.Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuelproduction.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2011,108(32):13212-13217.)，这使得常规表达系统所对应的一些载体元件包括筛选标记、报告基因等难以有效用于该CTG类酵母中。