[发明专利]应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及一种品系鉴定方法，特别涉及一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定。

背景技术

PCR技术是DNA扩增最常用的方法，但这一方法有其自身的弊端，如需要精密的仪器以及繁琐的试验流程、不能用于现场检测等。核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术，只需在恒定温度条件下即可进行反应，且具有简便、快速、灵敏等优点，相对于PCR技术来说有很大的优势。目前等温扩增技术主要有四种，包括环介导的等温扩增(LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASDA)、链置换扩增(SDA)以及重组酶介导的等温扩增(RPA)。

RPA技术模拟了生物体内DNA复制的过程，重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合，形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子，对模板DNA序列进行比对，搜索出与之匹配的序列。在单链结合蛋白的帮助下，双链模板DNA解链，引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸，并形成新的DNA。RPA的引物长度在35nt左右，在设计引物时应避免前后引物之间形成二级结构、GC含量尽量控制在40％-60％之间以及尽量避免引物出现重复序。RPA反应的探针也需具有特殊的结构和修饰方式，在探针的中后部选择两个T碱基，各标记一个荧光集团(FAM和BHQ1)，在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割，使两个荧光集团分离产生荧光信号，且特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果，RPA荧光检测技术在20分钟内就可以完成，因此在短时间内就可以快速扩增出目的片段。

转基因玉米BT11是先正达种子有限公司研发的产品，具有抗虫和耐除草剂特性，是目前用于加工食品和饲料较多的转基因玉米品系之一。BT11转基因玉米已经在美国(1996)、欧盟(1998)、中国(2004)等国家和地区进行大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。在已报道的对转基因玉米BT11检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测，也有应用于环介导的等温扩增(LAMP)技术对其进行检测，目前还没有利用RPA技术对其进行基因特异性鉴定。

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转基因玉米BT11品系特异性的检测方法。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种鉴定转基因玉米BT11品系的试剂盒，包含上述的引物和探针。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法，提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测，如果得到扩增曲线，则证明所检样品含有转基因玉米BT11成分；如果得不到扩增曲线，则证明所检样品不含有转基因玉米BT11成分。

所述RPA快速扩增的反应体系为50μl，包括10μmol/L的引物各2μl，10μmol/L的探针0.5μl，模板DNA 50ng，缓冲溶液Buffer 29.5μl，其余用去离子水补齐。

所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟；同时进行实时荧光检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明根据外援插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT11成分的引物及探针组合。以转基因玉米BT11为模板，利用该对引物和探针进行荧光检测，可以得到明显的扩增曲线，以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线。将模板DNA用水稀释至2000，1000，500，100，50，10个拷贝，结果只有10拷贝时未能扩增，其它都有扩增曲线，具有较高的灵敏度。本发明首次提供了转基因玉米BT11品系特异性的RPA检测方法。

附图说明