[发明专利]一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed及其应用

权利要求书

1.一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed的应用，其特征在于：

①以该转基因油菜的种子作为候选物制备转基因油菜筛查检测基体标准物质；

②以该转基因油菜的叶片作为候选物制备转基因油菜筛查检测基因组DNA标准物质；所述转基因油菜SD-rapeseed携带11个常用的转基因筛查靶标，序列如SEQ ID NO.1，包括3个启动子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4个标记基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4个终止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9；

P-35S的序列如SEQ ID NO.2、P-FMV35S的序列如SEQ ID NO.3、P-NOS的序列如SEQ IDNO.4、Bar的序列如SEQ ID NO. 5、NPTII的序列如SEQ ID NO.6、HPT的序列如SEQ ID NO.7、Pmi的序列如SEQ ID NO.8、T-NOS的序列如SEQ ID NO.9、T-35S的序列如SEQ ID NO.10、T-g7的序列如SEQ ID NO.11和T-e9的序列如SEQ ID NO.12；

所述转基因油菜SD-rapeseed中只有一个读码框P-NOS-NPTII-T-NOS正常表达，其他基因或元件均无活性；所述转基因油菜SD-rapeseed的制备方法如下：

（1）以常规油菜品种中双6号作为遗传转化材料，采用农杆菌介导法，将聚合了所述11个常用的转基因筛查靶标的T-DNA，转化到油菜中，获得T0代转基因油菜植株；

（2）利用伯乐公司QX200微滴式数字PCR系统，从11个外源靶标中随机选择HPT代表外源基因拷贝数，选择内标准基因CruA表征油菜的基因组；通过检测HPT和内标准基因CruA的拷贝数的比值，鉴定出T0代中HPT基因为单拷贝的转基因油菜植株，利用微滴数字PCR分别检测其他10个外源元件与内标基因CruA的比值，鉴定出所有外源基因均为单拷贝的纯合单株；

（3）将T0代单拷贝转基因植株自交，收获并种植T1代种子；每个单株的T1代种植30棵；通过定性PCR检测，拔除阴性植株并记录；采用微滴式数字PCR系统，分别对T1代植株中的筛查元件HPT和作物内标基因CruA的拷贝数进行检测，通过二者的比值筛选出纯合转基因单株；油菜纯合体比值为1：2，杂合体比值为1：4；选择综合性状最好的单拷贝纯合转基因单株。

2.一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜的制备方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

（1）以常规油菜品种中双6号作为遗传转化材料，采用农杆菌介导法，将聚合了11个常用的转基因筛查靶标的T-DNA，转化到油菜中，获得T0代转基因油菜植株，所述11个常用的转基因筛查靶标序列如SEQ NO.1，包括3个启动子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4个标记基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4个终止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9；

P-35S的序列如SEQ ID NO.2、P-FMV35S的序列如SEQ ID NO.3、P-NOS的序列如SEQ IDNO.4、Bar的序列如SEQ ID NO. 5、NPTII的序列如SEQ ID NO.6、HPT的序列如SEQ ID NO.7、Pmi的序列如SEQ ID NO.8、T-NOS的序列如SEQ ID NO.9、T-35S的序列如SEQ ID NO.10、T-g7的序列如SEQ ID NO.11和T-e9的序列如SEQ ID NO.12；

（2）利用伯乐公司QX200微滴式数字PCR系统，从11个外源靶标中随机选择HPT代表外源基因拷贝数，选择内标准基因CruA表征油菜的基因组；通过检测HPT和内标准基因CruA的拷贝数的比值，鉴定出T0代中HPT基因为单拷贝的转基因油菜植株，利用微滴数字PCR分别检测其他10个外源元件与内标基因CruA的比值，鉴定出所有外源基因均为单拷贝的纯合单株；

（3）将T0代单拷贝转基因植株自交，收获并种植T1代种子；每个单株的T1代种植30棵；通过定性PCR检测，拔除阴性植株并记录；采用微滴式数字PCR系统，分别对T1代植株中的筛查元件HPT和作物内标基因CruA的拷贝数进行检测，通过二者的比值筛选出纯合转基因单株；油菜纯合体比值为1：2，杂合体比值为1：4；选择综合性状最好的单拷贝纯合转基因单株。