[发明专利]一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；

步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；

步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；

步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；

步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；

步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；

步骤G：对PCR扩增产物进行检测；

步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。

2.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤B中，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。

3.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤D中，所述基因组DNA提取的步骤如下：

步骤D1：对抽取的样品初烤烟叶烘干，并研磨粉碎至烟叶粉末；

步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；

步骤D3：利用BioMek NX^p自动化工作站进行DNA提取。

4.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤E中，通过紫外吸收法对所提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，所述DNA质量合格。

5.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤F中，SSR标记PCR扩增反应体系为：

10×PCR buffer，1.25μl；

dNTP，0.2μl；

TaqDNA polymerase，0.2μl；

灭菌水，6.95μl；

正向引物，0.2μl；

反向引物，0.2μl；

模板DNA，1μl。

6.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度检测抽样方法，其特征在于，

所述步骤F中，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。

7.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤G中，所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺电泳进行检测。

8.根据权利要求7所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述步骤H中，对检测的结果进行分析计算时，品种纯度合格率＝抽检合格批次/抽检总批次×100％。

9.根据权利要求1所述的基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其特征在于，

所述烤烟品种为红花大金元、K326、云系。