[发明专利]一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抽样检测方法，尤其是涉及一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法。

背景技术

烤烟品种特色优质品种红花大金元、K326、云系等深受卷烟工业企业的青睐，市场优势明显。由于受利益驱使、毗邻产区补贴政策、超产或减产等诸多因素的影响下，杂劣品种进入收购环节和烟叶跨产区流动时有发生，产区烟叶品种纯度波动真实存在。并且，随着宏观经济环境下行压力加大，控烟环境日趋严厉，工业企业烟叶原料库存高位运行和原料定额采购，烟叶市场需求拐点显现。已有部分工业企业提出对质量特点不明显、品种纯度不稳定、收购等级质量不高的产区下调需求计划。

目前，还缺少科学有效的收购和工商交接环节烤后烟叶品种纯度抽样检测方法，品种的判定主要依据外观形态特征和判断者的经验。但烤后烟叶的外观形态受遗传、环境、烘烤等因素的多重影响，并非是截然可辨的特征，特别是非正常气候和生产条件下的烟叶外观形态较为混杂，变化规律复杂，容易引起误判，判定准确率较低。

烤烟国标是目前分级、交售、收购、工商交接唯一可执行的强制标准。烤烟国标(GB2635-92)7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但从成本和时效性上考虑对于DNA分子标记品种检测显然无法抽取如此大样品数量进行逐一检测。烤烟收购和工商交接工作中唯一可执行的标准为烤烟国标GB2635-92。烤烟国标中7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但对于DNA分子标记检测这类成本较高的检测方法，样本抽样数量过大不具有现实可行性。

由此可见，现有的烤烟的抽样检测方法存在着抽样量大，检测效果差，效率低，成本高的缺陷，亟待进一步改进。

发明内容

本发明的目的是提供基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度检测方法，以解决现有技术的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其包括以下步骤：

步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；

步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；

步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；

步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；

步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；

步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；

步骤G：对PCR扩增产物进行检测；

步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。

本发明的一个实施例中，所述步骤B中，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。

本发明的一个实施例中，所述步骤D中，所述基因组DNA提取的步骤如下：

步骤D1：对抽取的样品初烤烟叶烘干，并研磨粉碎至烟叶粉末；

步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；

步骤D3：利用BioMek NX^p自动化工作站进行DNA提取；

本发明的一个实施例中，所述步骤E中，通过紫外吸收法对所提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，所述DNA质量合格。

本发明的一个实施例中，所述步骤F中，SSR标记PCR扩增反应体系为：

10×PCR buffer，1.25μl；

dNTP，0.2μl；

TaqDNA polymerase，0.2μl；

灭菌水，6.95μl；

正向引物，0.2μl；

反向引物，0.2μl；

模板DNA，1μl。

本发明的一个实施例中，所述步骤F中，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。

本发明的一个实施例中，所述步骤G中，所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺电泳进行检测。