[发明专利]一种检测AQP‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种用于AQP-4基因沉默的RNAi序列，其特征在于，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：

stealth_121 GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAA

stealth_control_121 GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAA

stealth_149 GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAA

stealth_control_149 GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAA

stealth_595 GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGT

stealth_control_595 GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGT

stealth_710 CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATC

stealth_control_710 CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。

2.一种AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，其特征在于，所述星状胶质细胞借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默，AQP-4的蛋白敲除效率不低于65％。

3.一种检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。

4.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述阴性对照孔的细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％。

5.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述检测孔和阴性对照孔为分别设置在聚碳酸酯板上、并借助联通沟形成联通结构的凹槽。

6.根据权利要求5所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述凹槽直径为6mm，深度为0.5mm；联通沟(1)的宽度为1mm，深度为0.5mm。

7.检测AQP-4自身抗体的芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述方法包括以下步骤：

1)将原代分离的星状胶质细胞以1×10⁵个/mL的浓度、0.1mL/孔的量分别接种至芯片的检测孔和阴性对照孔内，37℃、5％CO₂条件下培养24-48h；

2)借助权利要求1所述的RNAi序列及RNA干扰试剂盒对阴性对照孔的细胞进行干扰处理48h；

3)对检测孔和经干扰处理的阴性对照孔内的细胞依次进行PBS磷酸盐缓冲液洗涤、4％多聚甲醛固定15-30min、PBS磷酸盐缓冲液浸泡15-40min，最后分别加入含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液并密封，避光4℃保存。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)培养时芯片置于装有蒸馏水的培养皿内，下部以载破片垫起。

9.检测AQP-4自身抗体的芯片在制备检测AQP-4自身抗体的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用时包括以下步骤：

1)将样本血清以PBS磷酸盐缓冲液稀释5-20倍，得待检样本；

2)打开芯片，以PBS磷酸盐缓冲液洗涤、浸泡10-30min并移除，分别向检测孔和阴性对照孔加入10％驴血清，37℃封闭15-40min后移除；

3)分别向检测孔和阴性对照孔加入待检样本至覆盖孔底，孵育3-15h；

4)PBS磷酸盐缓冲液洗涤2-4次，分别加入驴抗人荧光抗体并按其配套的使用方法避光孵育，最后避光冲洗2-5次，以荧光显微镜观察，比较检测孔和阴性对照孔的荧光强度。