[发明专利]化学‑酶法制备熊去氧胆酸

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是1927年日本正田氏从熊胆汁中首次分离出纯结晶产品，1957年UDCA被成功合成并作为利胆剂用于临床。1973年日本发现UDCA有溶解胆结石的作用,且具有毒性小、剂量小的优点，从而引起世界各国的关注。熊去氧胆酸是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性的抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白激酶来增强胆汁淤积肝细胞的分泌能力，使血液及肝细胞中的内源性疏水胆酸浓度降低，达到抗胆汁淤积的作用。

熊去氧胆酸的国外市场需求量大，尤其是日本、韩国、欧美等国家，出口形势较好，国内市场也渐渐在扩大。据统计资料显示，全球对熊去氧胆酸需求量约为1200吨，每年均有15％的增长，尽管日本人口较少，但是每年消耗熊去氧胆酸高达300吨，韩国也高达100吨以上。因此越来越多的科研工作者开始探索熊去氧胆酸的新制备工艺，力求降低熊去氧胆酸的现有产品价格。

目前熊去氧胆酸的制备方法分为化学法和生物法，由于化学法合成路线较长、反应条件苛刻、收率低、产物立体选择性差导致后处理纯化步骤增多，人们逐渐关注于生物法制备UDCA的研究。

CN103012532公开了以牛羊胆酸为原料，经酯化、3,7位乙酰化、12位氧化、脱氧、7位氧化、还原得到UDCA的方法，总收率为32％，产品纯度最高为98.5％，合成路线如下：

该化学合成方法路线冗长，总收率较低，反应条件苛刻，对环境影响较为严重，放大生产对设备要求较高，能耗较大，生产成本大幅度提高。

CN105861613公开了以鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，在两种酶7-αHSDH和7-βHSDH、辅酶NADP的作用下经重结晶精制一步得到熊去氧胆酸的方法，收率最高为81％，合成路线如下：

该方法虽然收率较高为81％，但是由于原料CDCA通常都是用从禽胆汁中分离、提取、纯化，而现实生活中存在禽胆汁量较少，难以收集的问题，所以该路线工业化放大生产受阻，难以满足人们的需求。

CN102791876公开了原料胆酸(CA)经氧化、7β-HSDH还原、3α-HSDH还原、12位化学法脱氧四步反应得到UDCA，合成路线如下：

该路线的酶法制备步骤中底物浓度较低只有20g/L，仅停留在实验室研究阶段，难以进行工业化应用。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。

具体工艺路线如下所示：

合成步骤包括：

步骤a：去氧胆酸(化合物II)在12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-HSDH)、辅酶、第一辅酶再生体系、磷酸盐缓冲液的作用下发生氧化反应得到12-酮去氧胆酸(化合物III)；

步骤b：化合物III进行脱羰基还原反应得到胆石酸(化合物IV)；

步骤c：化合物IV在7α-羟化酶(7α-LCAH)催化作用下进行羟基化反应得到熊去氧胆酸(化合物I)。

进一步说，步骤a中所述辅酶为NAD或NADP。

进一步说，步骤a中所述第一辅酶再生体系为醇脱氢酶/丙酮体系或乳酸脱氢酶/丙酮酸体系，优选为醇脱氢酶/丙酮体系。

进一步说，步骤a中化合物II的浓度为20～100g/L，12α-羟基类固醇脱氢酶的浓度为5～10g/L，丙酮浓度为5～20％(V/V)，辅酶的浓度为0.01～0.1g/L，醇脱氢酶的浓度为1～5g/L，磷酸盐缓冲液的浓度为40～80mM。

进一步说，步骤a的氧化反应在pH＝6～8，温度为30～40℃进行。

进一步说，所述12α-羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶源自尚科生物医药(上海)有限公司，优选12α-HSDH101和KRED195。

进一步说，步骤b中所述脱羰基还原反应在180～220℃、水合肼作用下进行。

进一步说，步骤b中水合肼与化合物III的摩尔比为1:1～1:3。

进一步说，步骤c的羟基化反应是将化合物IV、7α-LCAH、辅酶、第二辅酶再生体系、磷酸盐缓冲液按一定比例混合反应得到。

进一步说，步骤c中所述第二辅酶再生体系为醇脱氢酶/异丙醇体系。