[发明专利]N‑羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法。

背景技术

生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。生物素-亲合素系统已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。

生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(α型)和肝组织(β型)，提取αβ两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31，分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP)。然而上述两种活化生物素的水溶性均较差，但是被标记的蛋白质等生物大分子通常以水作为最佳溶剂。为了增进生物素标记反应的效率，可以将生物素修饰成水溶性较好的N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯，Sulfo-NHS。该活化生物素可以与被标记物在水相中顺利发生均相反应，生成连接有生物素的生物大分子，应用于各种检测以及定位观察等研究领域。

N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯的反应活性较高，容易在制备和储存的过程中变质，至今没有成熟的合成方法被报道。

发明内容

本发明之目的是提供一种原料易得、工艺简单、环境友好，并且适合大量生产的N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，能够避免了产物在后处理过程中变质分解，解决高活性水溶性活化生物素的制备困难问题。

由此，本发明提供一种N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，该方法是使生物素与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐发生反应而得到N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物，化学反应式如下：

在上述反应式中，代表N-羟基琥珀酰亚胺磺酸或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐的分子式，其中，R表示H或M，而M则表示金属离子、铵离子或季铵离子；

代表N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的分子式，其中，R表示H或M，而M则表示金属离子、铵离子或季铵离子，

该方法包括如下步骤：

步骤一：将生物素与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐加入到第一溶剂中，在缩合剂的作用下发生缩合反应；

步骤二：将步骤一反应后得到的反应液中的所述第一溶剂去除，剩余物用色谱进行分离，并收集含有N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物的分离溶液；

步骤三：去除所述分离溶液中的第二溶剂，得到N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物。

作为优选方式，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、氯化亚砜或草酰氯。

作为优选方式，所述第一溶剂为二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。

作为优选方式，步骤三中去除分离溶液中的第二溶剂的方式为冻干、旋转蒸发或其组合。

作为优选方式，步骤二中所述色谱为高效液相色谱或中压制备色谱。

作为优选方式，所述第一溶剂可以与所述第二溶剂相同或不同。

本发明还提供一种N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的制备方法，该方法是使生物素与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐发生反应而得到N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯或其衍生物，化学反应式如下：

在上述反应式中，代表N-羟基琥珀酰亚胺磺酸或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸盐的分子式，其中，R表示H或M，而M则表示金属离子、铵离子或季铵离子；

代表N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素酯及其衍生物的分子式，其中，R表示H或M，而M则表示金属离子、铵离子或季铵离子，

该方法包括如下步骤：