[发明专利]一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，具体为以SIVmac_1A11慢病毒为骨架，表达SpCas9蛋白及基因特异性的sgRNA，用于治疗人和猴艾滋病。

背景技术

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关的Cas9蛋白系统(CRISPR/Cas9)是细菌和古细菌用于抵御外源病毒感染的天然防御机制。外源的DNA入侵细菌/古细菌后，会被细胞中与外源DNA特定区域互补的RNA引导序列(guideRNA)识别，并引导Cas9核酸酶到达识别部位，对目标序列进行酶切，从而降解外源DNA。此系统具体工作原理如下：crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物能够引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的目标序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的单链sgRNA(singleguide RNA)，引导Cas9对DNA进行定点切割。

作为一种RNA导向的双链DNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。因此CRISPR/Cas9很快作为新的基因编辑工具被广泛应用于遗传工程、作物育种以及基因治疗等领域。

艾滋病是一种难以根治的慢性传染病。尽管联合抗逆转录病毒治疗可以控制HIV-1病毒的复制，维持患者的生存，但是药物的副作用以及长期用药产生的抗药性等问题仍然存在，寻找更有效，且能改善患者生存质量的治疗策略是艾滋病研究领域的重点和难点。艾滋病的基因治疗已涉及到病毒感染宿主的整个生命周期，其中靶向病毒入侵门户——辅助受体CXCR4和CCR5的治疗策略已经在临床上展现了曙光。2007年一位感染HIV-1且身患急性髓细胞性白血病的男子，经过异体移植CCR5基因天然缺失32个碱基(CCR5Δ32/Δ32)的供者骨髓后，至今仍未检测到体内病毒的反弹，且身体状况良好，被公认是全球第一例被治愈的艾滋病患者。后续的研究表明，表型的供者骨髓是实现根治的关键。然而天然携带CCR5Δ32/Δ32基因型的人数稀少，且存在HLA配型等问题，限制了此疗法的推广。此外，已有大量研究证实，HIV-1不同的毒株具有不同的共受体嗜性(CCR5嗜性，CXCR4嗜性，X4-R5双嗜性等)，并且同一个患者体内也存在不同嗜性的HIV-1变异体。因此利用遗传工具来修饰患者自身CCR5、CXCR4等基因，并自体回输，用于控制和治疗HIV-1感染，有可能最终实现功能性治愈。

CN 104480144 A公开了一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得。其采用的是人的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，其安全性不高。

恒河猴作为艾滋病研究的模型，具有小鼠所不具有的优势：首先猴与人的遗传背景更为接近；其次，研究已证实HIV-1起源于SIV，HIV-1感染人的病程和病理特征与SIV感染恒河猴十分相似。因此，用恒河猴感染SIVmac251作为慢性感染模型，对于临床治疗HIV-1感染具有重要的参考意义。以往的研究中，利用锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)对猕猴的胚胎细胞进行基因的特异性修饰，用于获得转基因猴，但是对于分化的外周原代细胞的基因修饰，所能运用的技术手段有限。利用腺病毒或者腺相关病毒作为载体传递ZFN或TALEN能够对外周血细胞进行适度的修饰，但是这两种技术的运用较为复杂，而腺病毒本身对恒河猴有免疫原性，可能会影响基因修饰的效果。

因此采用SIV慢病毒载体，传递CRISPR/Cas9，既能提高感染原代细胞的效率，同时也能更为方便快捷高效地对目的基因进行修饰，提高基因修饰的安全性。

发明内容