[发明专利]细胞色素P450突变蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种细胞色素P450突变蛋白及其应用，具体地，本发明对细胞色素P450 CYP716A47中的关键位点进行改造后，可以显著提高PPD产量以及PPD/DM比例。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学、天然产物药物领域，具体地，本发明涉及一种细胞色素P450突变蛋白及其应用。

背景技术

人参皂苷是五加科人参属植物(如人参、三七、西洋参等)中的主要活性物质，近年来在葫芦科植物绞股蓝中也发现一些人参皂苷。目前，国内外科学家已经从人参、绞股蓝等植物中分离出了至少100多种人参皂苷，这些皂苷在人参中的含量差别非常大。其中一些疗效显着的三萜皂苷在天然总皂苷中含量极低(亦被称为稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以价格就非常昂贵。目前多种皂苷已经用于临床，如以人参皂苷Rg3单体为主要成分的药物参一胶囊可改善肿瘤患者的气虚症状，提高机体免疫功能。以人参皂苷Rh2单体为主要成分的今幸胶囊是一种保健药品用于提高机体免疫力，增强抗病能力。

由于稀有人参皂苷往往具有独特生物活性或更显著疗效，传统制备稀有人参皂苷都是从人参或三七中提取的大量皂苷经过化学水解法、酶法水解和微生物法水解来制备。由于野生的人参资源已基本耗竭，人参总皂苷资源目前主要来源于人参或三七的人工栽培，而其人工栽培的生长周期长(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，还经常受到病虫害而需要施用大量的农药，所以，人参或三七的人工栽培有严重的连作障碍(人参或三七种植地需要休耕5-15年以上才能克服连作障碍)，所以人参皂苷的产量、品质及安全性都面临挑战。另一方面，以人参总皂苷为原料来制备单一成分的皂苷，因为总皂苷中还有大量的成份无法转化为目标人参皂苷单体(例如原人参三醇型皂苷)无法得到利用，不仅造成资源的浪费，还会增加抽提纯化成本。

合成生物学的发展为植物来源的天然产物的异源合成提供了新的机遇。以酵母为底盘，通过代谢途径的组装和优化，已经实现了用廉价的单糖来发酵合成青蒿酸或者双氢青蒿酸，继而再通过一步化学转化的方法生产青蒿素，这表明合成生物学在天然产物的药物合成方面具有的巨大潜力。利用酵母底盘细胞通过合成生物学方法异源合成稀有人参皂苷单体，原料为廉价的单糖，制备过程为安全性可调控的发酵过程，避免了任何外来污染(例如，原料植物人工种植时使用的农药)，因此，通过合成生物学技术制备稀有人参皂苷单体，不仅具有成本优势，而且，可以保证成品的品质与安全性。利用合成生物学技术制备足够量的各种高纯度稀有人参皂苷单体，用于活性测定及临床实验，促进稀有人参皂苷的创新药物研发。

利用合成生物学方法来人工合成具有药用活性的人参皂苷，首要需要解析与重构原人参二醇PPD的合成代谢途径。由于人参皂苷属于三萜化合物，植物中MVA和MEP代谢途径提供了萜类化合物的共同前体IPP和DMAPP，为三萜化合物前体角鲨烯和2,3-环氧角鲨烯的合成奠定了基础由于目前的细胞色素P450 蛋白催化达玛烯二醇合成原人参二醇催化活性很低，在利用微生物细胞工厂生产PPD时是一个限速步骤，不仅限制了PPD产量的提高也导致了中间产物DM的积累。

因此，本领域需要对细胞色素P450进行更多的研究和改造，以获得更高效的细胞色素P450蛋白元件从而促进人参皂苷细胞工厂合成效率。

发明内容

本发明提供了一种细胞色素P450突变蛋白，通过采用所述的突变蛋白可以产生很高的PPD产量以及PPD/DM比例。

本发明的第一方面提供了一种细胞色素P450的突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化生成原人参二醇的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的细胞色素P450的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组的一个或多个与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第91位脯氨酸(P)；

第87位亮氨酸(L)；

第235位赖氨酸(K)；

第349位赖氨酸(K)；

第366位缬氨酸(V)；