[发明专利]基于高通量测序检测大前庭导水管综合征致病基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测大前庭导水管综合征致病基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法。

背景技术

大前庭导水管综合征(Large Vestibular aqueduct Syndrome，LVAS)是在70年代末被发现的一种先天遗传性内耳畸形性听力障碍，是以前庭导水管扩大伴有感音神经性聋(SNHL)为特征的一种常染色体隐性遗传性听力障碍性疾病，临床上主要表现为高频听力损失为主的感音神经性耳聋，听力损失程度多表现为重度或者是极重度聋，可同时伴有反复发作的耳鸣或眩晕等一系列临床症状。发病多在儿童时期，其发病前常有感冒、发烧、外伤等使颅内压增高的诱因。今年来多项临床研究表明，非综合征性耳聋患儿中FOXI1、KCNJ10、SLC26A4基因突变发生率较高，对初步怀疑为大前庭导水管综合征想要了解病因的患者，建议进行FOXI1、KCNJ10、SLC26A4基因检测。基因检测对大前庭导水管综合征疾病筛查、预防及诊断有一定作用，如发现耳聋遗传病因，提早干预，指导人工耳蜗植入或指导科学婚育，降低下一代患耳聋的风险。做到“早发现，早预防，早治疗”。

SLC26A4(Solute Carrier Family 26Member 4)属于溶质载体家族26中4号成员，位于7号染色体上的蛋白编码基因，大小为57175bp，共编码780个氨基酸，其生物学活性为次级活性硫酸盐跨膜转运蛋白活性和氯离子跨膜转运蛋白活性，近年来国外多项研究表明SLC26A4基因突变与Pendred综合征(PDS)(前庭水管扩大或伴内耳畸形神经性聋和甲状腺肿)和大前庭导水管综合征(LVAS)有密切的关系。

FOXI1(Forkhead Box I1)属于叉头转录因子家族，位于5号染色体上的蛋白编码基因，大小为3829bp，共编码378个氨基酸，其生物学活性位为转录因子活性及序列特异性DNA结合活性，对耳蜗和前庭的发育有至关重要的作用。而FOXI1基因突变则可能通过影响耳内腔表型正常功能来影响正常听力。

KCNJ10(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily J Member 10)属于内向整流型钾通道家族，位于1号染色体上的蛋白编码基因，基因大小为71421bp，共编码379个氨基酸，其通道相关途径包括内向整流K+通道和钾通道，所编码的蛋白质也可与另一种钾通道蛋白形成异源二聚体，负责脑中神经胶质细胞的钾缓冲作用，为细胞提供钾离子输入通道。而KCNJ10基因突变则可能通过影响钾通道正常功能来影响听力发育。

目前，检测大前庭导水管综合征常见方法有Sanger法、基因芯片法、荧光定量PCR法、多色荧光溶解曲线分析法、高通量测序法等。Sanger测序法测序每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低、成本高，且灵敏度低(20％)。基因芯片法、荧光定量PCR法检测大前庭导水管综合征致病基因，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。多色荧光溶解曲线分析法，所用的荧光染料是通用的双链DNA嵌入剂，对引物二聚体和非特异扩增产物无法识别，容易造成假阳性。高通量测序法主要是由测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，由供应公司质控评估，存在试剂盒货期长、试剂盒规格固定、试验灵活性不够等不足。一些试剂厂商根据文献中分享报道的实验方法进行建库，但所完成的实验效果参差不齐，测序质量不高。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于高通量测序平台检测大前庭导水管综合征致病基因的多重PCR特异性引物、试剂盒和实验方法，能够同时检测多个样本多个大前庭导水管综合征致病基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于高通量测序技术检测大前庭导水管综合征致病基因的多重PCR特异性引物，包括43对特异性引物，所述特异性引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：86所示。

进一步的，所述特异性引物为经过修饰的引物。

进一步的，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。

进一步的，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。

一种基于高通量测序技术检测大前庭导水管综合征致病基因的试剂盒，包括上述特异性引物中的至少两对。