[发明专利]镰刀菌病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

说明书

本发明提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒。所述引物和探针组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑12所示。本发明的试剂盒能够快速、特异、灵敏、稳定对角膜镰刀菌病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的镰刀菌病病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明提供的试剂盒包含改良的DNA提取体系，能快速有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

背景技术

真菌性角膜炎是一种世界范围内常见的致盲性眼病，多见于包括中国在内的农业人口为主的发展中国家。其中，又以镰刀菌属真菌引起的角膜镰刀菌病最为常见。统计资料表明，同仁医院眼科研究所报告的775例真菌性角膜炎中，角膜镰刀菌占58.7％，其病原菌以茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌为主。

近年来，随着广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛应用，角膜镰刀菌病的发病率有较明显的上升趋势。角膜镰刀菌病起病缓慢，外用抗生素无效，早期主要症状包括疼痛、畏光、红肿、视力模糊，如治疗不及时，可以引起角膜穿孔，导致失明。因此，真菌性角膜炎的早期诊断对防盲、治盲意义重大，只有早期及时确诊，才能合理治疗。

目前，临床上常用的诊断方法包括镜检、培养、共聚焦显微镜检查、组织病理检查等。但除培养外，都不能达到真菌鉴定到种水平。而真菌培养，耗时过长，一般需1-2周，不适用于临床早期诊断。因此，开发精准的分子诊断技术，用于对角膜镰刀菌病的诊疗，有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种用于非疾病诊断目的检测镰刀菌病病菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种改良的真菌DNA提取液。

为了实现本发明目的，本发明的镰刀菌病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，该组合包括：

(I)用于检测镰刀菌的通用引物和探针，所述镰刀菌包括茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌(SEQ ID NO:1-3)

Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′

Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′

Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′

(II)用于检测串珠镰刀菌的特异性引物和探针(SEQ ID NO:4-6)

Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′

Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′

Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；

其中，[T]表示锁核酸；

(III)用于检测茄病镰刀菌的特异性引物和探针(SEQ ID NO:7-9)

Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′

Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′

Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及