[发明专利]一种肌肉干细胞的体外高效培养方法

说明书

技术领域

本发明一种肌肉干细胞的体外高效培养方法，涉及一种包括肌肉组织消化酶，肌肉细胞培养基和细胞培养板包被溶液的通用型肌肉干细胞体外培养试剂盒，属于生物技术领域，特别涉及一种可以快速获取并扩增肌肉干细胞，并保持肌肉干细胞的再生活力的方法。

背景技术

肌肉干细胞，即卫星细胞，是肌肉组织中存在于肌纤维的肌膜与基底膜之间，形态为小梭形扁平的单个核细胞。肌肉干细胞在肌肉组织受损，肌纤维发生断裂的情况下被激活，而后肌肉干细胞会大量增值，并且相互融合形成再生型肌纤维，从而补充替代受损肌纤维。肌肉干细胞的这些功能，是肌肉组织维持稳定（homeostasis）和再生（regeneration）的基础。骨骼肌再生障碍性疾病患者，肌肉干细胞的功能受损，而且其数量也下降，从而导致肌肉再生障碍。这类患者的肌肉组织无法维持正常的结构和功能，大量纤维组织代替了正常的肌肉组织，肌肉的正常结构被破坏，肌肉的力量也逐渐下降,从而严重影响患者生活水平，甚至危及生命。骨骼肌再生障碍性疾病是再生医学所针对的一类典型疾病。这类疾病包括肌肉退行性病、外伤、衰老和癌症恶液质等，影响着广泛人群。再生医学的目标，是恢复疾病组织和器官的正常功能和再生能力。肌肉干细胞治疗的策略是投放肌肉干细胞来修复受损肌肉，进而扭转上述疾病过程，甚至治愈疾病。而治疗所投放的细胞需要具备两个重要的功能：重建受损的肌肉纤维和补充肌肉内干细胞的数量。这样才能实现恢复受损组织及其再生能力，也正是再生医学的目的。

此外，以体外组织工程代表的生物技术，也需要大量的，具有再生能力的肌肉干细胞，这样才能生成具有肌肉功能的人工组织，才能使下游工作例如药物筛选，医学发育组织学模型等成为可能。

细胞来源一直是肌肉组织干细胞治疗的一个重大问题。治疗一块肌肉通常需要几千万到几亿细胞。这意味着要想获得如此多的细胞，细胞扩增是必须的技术手段。从九十年代至今，已经有十数个临床试验使用这一策略，即获取肌肉活检，培养和大规模增殖肌肉来源的细胞，然后将这些细胞注入患者的肌肉组织。但是，这些临床研究的一直无法得到显著的治疗效果，无论肌肉组织的结构恢复还是肌肉力量，都只有不显著的、似是而非的改善。早期临床试验的问题一直到最近才被揭示出来。2005和2012 年的几篇在Science 杂志发表的研究，已经阐明了基本的原因： 肌肉干细胞在体外培养中会迅速失去再生能力，例如在体内形成肌肉纤维的能力在5-8天的培养后即接近完全丧失。本来肌肉干细胞治疗是希望注射入患者体内的细胞形成新的肌肉纤维并补充肌肉干细胞库，从而达到重建受损的肌肉组织的目的。 但是已有的临床试验没有意识到一个问题：即其所使用细胞培养技术无法保持骨骼肌干细胞的再生能力。这样的细胞注入患者体内，自然无法有效产生新的肌肉纤维，自然无法达到所设想的治疗效果。但直到今天，仍然可以检索到19 项正在实施的，使用这种失去功能的细胞进行的临床试验。此外，市场上常见的提供肌肉干细胞的公司仍然在使用这种过时的，会使细胞失去再生能力的培养技术来生产细胞。对于使用这样细胞的科研和临床用户，结果堪忧。

这一现象，显示了在临床治疗和科研中对于肌肉干细胞干性保持方面认识上的不足，代表了肌肉再生医学所必须面对和解决的一个重要问题。本发明即是为解决这一问题，为多种肌肉研究和临床应用提供再生功能有保障的肌肉干细胞。体外的肌肉诱导分化使用同细胞培养相同的培养基。细胞生长至高聚合度后开始自然分化，形成多个核的肌管结构。培养基广泛使用的肌肉培养方法例如Rando (1994)的方法，通常利用细胞贴壁能力的差异来提高肌肉前体细胞在培养中的纯度，并且使用bFGF来维持肌肉前体细胞的性状。我们发现上述的方法对于细胞干性的保持是有疑问的，例如上述这些方法无法保持细胞的Pax7表达，而这一蛋白是保持肌肉细胞体内外再生功能必不可少的。我们改变了培养方法，具体而言，培养基中含鸡胚提取物，培养板也使用胶原蛋白包被。这一创新使得培养的细胞保持Pax7表达，并且在体外可以稳定形成肌管，体内可以形成再生型肌肉纤维。

发明内容

本发明一种肌肉干细胞的体外高效培养方法提供了一种小鼠肌肉干细胞的制备方法，采用该方法，可方便快捷地获得大量的小鼠肌肉干细胞。这些细胞稳定表达肌肉干细胞标志物Pax7，保持体内体外再生活力，可以用于广泛的应用领域，包括但不局限于细胞治疗、组织工程、药物筛选，以及肌肉发育和分子生物学研究。