[发明专利]一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于检测方法包括如下步骤：

a)将单链DNA reporter与其互补单链s-reporter在Tris-Ac缓冲液中杂交形成双链探针dsNF-κB p50 probe；在步骤a）之前，配置Tris-Ac缓冲液，具体配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA, 100mM NaAc；

b) 10μL，50nM的dsNF-κB probe与体积都是5μL的30nM-2500nM的转录因子NF-κB p50的溶液混合，随后加入3μL，10U/μL的Exo III，在37℃下反应30min；反应缓冲体系：10mMTris–Ac, pH7.5, 100mM KCl,2mM MgCl₂, 0.1mM EDTA, 10%（v/v）glycerol，30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs，37℃下反应2h；

c)测定样品在561nm激发波长下，620nm处的荧光值，利用测得的I₆₂₀的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系；

d）从实际细胞或组织样品中获得核蛋白提取物作为待测样品，根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度；

其中，

Reporter：GAGGGGACTTTCCCAGCCCCACCCCACCCCACCCTCGTCATCAGATACTTA

s-reporter：ATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGGCTGGGAAAGTCCCCTC

制备AgMBs时所用的AgMBs模板的序列为：

CCCTTAATCCCCTCGTCAATGCGATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGG。

2.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于：步骤a）具体为：用Tris-Ac缓冲液溶解冻干的寡核苷酸，得到100μM的reporter与s-reporter，随后将二者等体积涡旋，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至室温，降温过程维持至少一小时。

3.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，步骤b）所述的AgMBs是通过以下步骤制备得到的：将1OD的AgMBs模板溶解于975μL缓冲液中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入12μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入12μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；其中，所述的缓冲液中为10mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄,100mMCH₃COONa,5 mM Mg(CH₃COO)₂, pH7.5。

4.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，步骤c）具体为：将样品低速离心后，装入石英比色皿进行荧光检测，检测条件是激发波长为561 nm，扫描速度为1200 nm min^-1，光电倍增管电压为700 V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5 nm。

5.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，模型转录因子为NF-κB p50。

6.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，转录因子NF-κB p50的浓度范围是30pM-2.5nM。