[发明专利]一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法

说明书

本发明公开了一种基于DNA‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，首次将DNA‑银纳米簇分子信标这种新型纳米材料作为荧光探针应用于转录因子的检测。并且，基于DNA‑银纳米簇分子信标的荧光调节是由可以被酶切割的DNA片段这一特征，加入了核酸外切酶III，既参与了信号的转化，又参与了检测信号的增强。本发明中转录因子的检测方法具有免标记，选择性高，低成本，灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高通量检测。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉以基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶 III循环放大的转录因子检测方法。

背景技术

转录因子(Transcription factors,TFs)是细胞中的一种调控蛋白，通过与基因中的DNA顺式作用元件结合，来启动和调节基因的转录过程。研究认为，转录因子决定了被调控基因的开启、关闭以及表达量，因此在基因表达中起着至关重要的作用。与此同时，也有大量研究指出，转录因子的非正常表达与活化，广泛的存在于人体的病理过程中，这些病理过程包括癌症的产生于转移、病毒感染、自身免疫疾病等，因此，转录因子既可以作为一种潜在的诊断标志物，又可以成为临床治疗的靶点。同时转录因子的表达水平也是基础生物医学研究中的一项重要参数。

综上所述，实现免标记，快速、灵敏、高通量检测转录因子是现在研究的热点之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种已DNA-银纳米簇分子信标(DNA-Ag nanoclustersmolecular beacons，AgMBs)为荧光探针，并且由核酸外切酶III(Exonuclease III， ExoIII)辅助循环信号放大的转录因子检测新方法，从而达到快速、灵敏并且高选择性的目的，克服现有转录因子检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。

一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其包括如下步骤：

a)将单链DNA reporter与其互补单链s-reporter在Tris-Ac缓冲液中杂交形成双链探针 dsNF-κB p50 probe；

b)将不同浓度的转录因子与dsNF-κB p50 probe孵育，再加入Exo III进行酶切，酶切后加入AgMBs，孵育反应；

c)荧光检测：测定样品在561nm激发波长下，620nm处的荧光值。利用测得的I₆₂₀的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系。

d)从实际细胞或组织样品中获得核蛋白提取物作为待测样品，根据所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度。

在步骤a)之前，配置Tris-Ac缓冲液，具体配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。市售购买本发明所需要的所有DNA寡核苷酸。具体见表1：

表1本发明中使用的DNA序列

步骤a)具体为：用Tris-Ac缓冲液溶解冻干的寡核苷酸，得到100μM的reporter与s-reporter，随后将二者等体积涡旋，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至室温，降温过程维持至少一小时。