[发明专利]一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法

说明书

本发明公开了一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。本发明以来源于Thermobifida fusca的角质酶，催化RB与槐糖的酯化反应；通过程序降温反应，降低酶的热失活并提高传质效应。本发明提供的方法，能够在甲醇、DMSO、DMF等溶剂中催化RB生成RD的反应，安全、高效、选择性高。此外，通过分阶段变温酯化，既加快反应的初速度，又通过生成的RD增溶RB，改善传质，加快反应速度。总的来说，本发明反应条件温和、产率高、产物分离纯化简单。

技术领域

本发明涉及一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。

背景技术

莱苞迪苷D(RD)，(4R)-13-[[2-O-(β-D-Glucopyranosyl)-3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy]kaur-16-en-18-oic acid 2-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl ester，是一种微量存在于甜叶菊中的天然甜味剂，其味质比目前通用的、可大量获得的莱苞迪苷A(RA)更接近蔗糖。RD一般用于RA或其它甜味剂的增味。RD作为甜菊糖产品中少量含有的物质在2010年9月通过了GRAS认证，作为高纯化合物在2015年4月通过了GRAS认证。

目前RD的获得主要靠植提，其人工合成还少见报道。RD的结构类似物莱苞迪苷B(RB)，13-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-(β-D-glucopyranosyl(1→3))-β-D-glucopyranosyl]-ent-13-hydrox y-kaur-16-en-19-oic acid，是莱苞迪苷D水解掉碳19位的槐糖后得到的一种甜菊苷，也是一种少量(一般不超过0.1％)存在于甜叶菊中的天然甜味剂，有后苦味，但它可以通过酶或碱催化水解RA脱除RA碳19位的一分子葡萄糖而大量获得。因此从结构上分析，可以通过RB的槐糖酯化来大量制备RD。

酯化反应可以通过酸或酶催化来进行。一方面，酸催化的酯化容易发生，但是要先保护RB分子碳13位上糖的羟基，以避免RB分子间的酯化。常见的糖羟基保护有众所周知的乙酰化反应，也曾用于三氯蔗糖合成中的糖羟基保护。另一方面，酶催化酯化比化学催化酯化温和，专一性强但。如果RB的槐糖酯化能够通过专一的选择性酯化实现，就可以避免保护和脱保护反应。糖酯的酶催化合成也多见报道，常用的有十多种商品化的脂肪酶，但其中应用最广泛的还是Novozym435。例如用Novozym435催化月桂酸和蔗糖在叔丁醇中的反应，可得到月桂酸蔗糖单酯和月桂蔗糖二酯。再如用Novozym435可催化合成海藻糖硫辛。不同来源的酶对于底物酰化试剂链长具有不同的选择性，多种来源于细菌和真菌的微生物细胞能够催化葡糖单酯合成反应，且假单胞菌属和真菌全细胞的反应活性与培养基中碳源种类显著。但是，RB是含有3个糖分子残基的酸，和上述脂肪酸完全不同。通过对现有二十余种商品脂肪酶的筛选，没有发现能够催化RB的槐糖酯化反应的脂肪酶。这可能是由于RB的溶解性问题，以及RD上羧基较大的空间位阻，故而上述脂肪酶均不能催化RB与槐糖的酯化反应；此外，RB的良溶剂往往对脂肪酶的活性有较大损伤，这也使得RB的酶催化槐糖酯化一直难以实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用角质酶催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，具有转化率高、速度快、选择性高、分离纯化简单等优点。

所述方法是以来源于Thermobifida fusca的角质酶，催化RB与槐糖的酯化反应；通过程序降温反应，降低酶的热失活并提高传质效应。

来源于Thermobifida fusca的角质酶催化RB与槐糖的酯化反应制备RD的反应方程式如下：