[发明专利]一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类方法及其应用

说明书

本发明公开了一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类的方法。本发明通过收集桑树病叶或感病部位的器官；提取桑树病叶或感病部位的器官的总DNA；Illumina DNA文库构建；Illumina高通量测序；去除测序数据中桑树基因组序列；组装微生物基因组序列；组装完整核糖体DNA序列；筛选标记微生物核糖体DNA序列；对比分析核糖体DNA序列进行种属分类实现对桑树病原菌的鉴定及种属分类。结果显示，运用本发明方法对桑树黑斑病病原菌进行鉴定及种属分类，共鉴定出16种真菌，其中相对丰度最高的为Pseudocercospor属病原菌，由此推定桑树黑斑病病原菌的病原菌为Pseudocercospora，并命名为Pseudocercospora mori；该属绝大部分为植物病原，大部分导致植物出现褐斑，与本发明叶片病征相符合。

技术领域

本发明涉及病原菌鉴定及种属分类技术领域，更具体地，涉及一种桑树病原菌高通量鉴定及种属分类的方法及应用。

背景技术

桑树我国重要经济作物，具有药用价值，关于桑树的病害这方面的研究较少，一方面是桑树的病害并不是常年大面积的发生，影响生产，而桑树的经济价值也没有高到小范围的发病会造成生产损失，发病通常会直接选择剪枝；另一方面则是了解某些病的病征有哪些，怎么防治解决，却不大关注病原的研究。这也是在真菌的系统分类变动巨大的时候，桑树病原真菌的信息却没有多少更新的原因。

以桑污叶病为例，桑污叶病为夏秋季寄生在桑叶上的常见病害之一，常与桑黑斑病相混淆，多发于成熟老化的叶片上，嫩叶上少有。硬化早的桑叶、通风透光差、离地面较近的叶片易发病。发病时病叶背面蒙上一层黑色烟煤状物，在对应的叶表面也产生同样大小的灰黄色至暗褐色变色斑。严重时病斑融合或布满叶背，造成整张叶片变色。该病使叶质变劣，提早硬化，容易萎凋，不适于饲养蚕(王向东，2009)。该病的传播主要以菌丝在病叶组织内越冬，次年夏秋两季，越冬菌丝上产生分生孢子，借风雨传播，引起初侵染，后在新病斑上又产生分生孢子进行再侵染(张月季，1975)。该病多发生在晚秋落叶前，常与桑叶白粉病同时发生。

传统分类上桑污叶病(mulberry leaf mold)的病原菌原为桑旋孢霉(Clasterosporium mori Sydow)，属半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，暗梗孢科(/暗色孢科)(Dematiaceae)，穿孢霉属(/穿孔霉属/刀孢)(Clasterosporium)(1985)；而关于桑污叶病菌属(Clasterosporium)在最近出版的《DictionaryoftheFungi》(第十版)(Kirk,etal.,2008)中，被划归为真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)，巨座壳目(Magnaporthales)，巨座壳科(Magnaporthaceae)。桑污叶病菌属(Clasterosporium)的系统分类从门(phylum)到科(family)全部改变。

现有研究方法中，利用传统形态学分类方法对植物病原菌的鉴定方法中，植物病原菌的分离纯化需根据病原菌的特性进行操作。植物病原菌分专性寄生和非专性寄生两种。专性寄生菌为只能在特定宿主上生长繁殖，不能在人工培养基上培养，如白粉病菌(Agrios，2004,Plants Pathology(5_thedition))，非专性寄生则没有限制。对未知的植物病原菌进行分离，方法有两种。一种是刮取病斑上的菌丝孢子，接种至PDA培养基上，将生长的菌落不断纯化至获得纯培养菌株；另一种方法则是将叶片表面消毒后，将叶片置于合适的环境，叶片内生的菌丝会形成分生孢子梗继续生长至在叶片上重新形成病斑。传统的鉴定方法往往耗时较长，且在可能在分离纯化的过程中，丢失部分病原菌种。