[发明专利]一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

说明书

本发明公开了一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明方法包括如下步骤：（1）构建以启动子序列‑信号肽编码序列‑葡糖苷酶编码序列‑终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同。（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。本发明利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。

背景技术

里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，纤维素葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。

一些多克隆研究中，有些通过多克隆的基因表达量增加的不多，或者是三拷贝的基因克隆与二拷贝的基因克隆相比，目标基因表达量几乎没有大的提升。已有的多克隆增加基因表达量的方法采用的都是相同的信号肽，信号肽对胞外酶的分泌具有重要的影响。信号肽与其连接的蛋白构成一个分泌的蛋白整体，这个蛋白整体的电荷分布、分子量大小、蛋白的形状等都影响到分泌的效率。相同信号肽连接的蛋白在外分泌的过程中可能有分泌竞争存在，这样即使是二克隆或三克隆表达的蛋白不能迅速分泌向胞外。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种葡糖苷酶多拷贝表达提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：

（1）构建以启动子序列-信号肽编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列为基本单元的葡糖苷酶多拷贝表达盒。表达盒中各单元的信号肽编码序列均不相同；相邻两个单元之间优选通过连接序列连接。

（2）在葡糖苷酶多拷贝表达盒两端加入限制性内切酶识别位点序列，通过限制性内切酶、DNA连接酶将表达盒构建到表达载体上。

（3）将构建的重组表达载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉菌株纤维素酶酶活得到提高。

步骤（1）中所述的葡糖苷酶多拷贝表达盒的组成优选为：启动子序列-信号肽1编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽2编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列-连接序列-启动子序列-信号肽3编码序列-葡糖苷酶编码序列-终止子序列。所述的启动子序列、信号肽1编码序列、葡糖苷酶编码序列、终止子序列、连接序列、信号肽2编码序列、信号肽3编码序列分别优选如SEQ ID NO.1-7所示。

步骤（2）中所述的表达载体优选为pCAMBIA1300；所述的限制性内切酶优选为EcoRI和PmeI。

步骤（3）优选通过农杆菌将构建的重组载体转化到里氏木霉中。

步骤（3）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。

一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉菌株。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明利用不同的信号肽进行组合，避免相同信号肽竞争，从而提高了里氏木霉所产纤维素酶的酶活。

具体实施方式

实施例1

1、材料