[发明专利]一种5`端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法，其包括如下步骤：

(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的DNA位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；

(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；

(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；

(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶切位点序列含有限制性内切酶的识别序列及酶切位点，所述的酶切位点能与识别序列分离；较佳地，所述限制性内切酶的酶切位点位于识别序列下游，即所述酶切位点序列与相邻的目的DNA的碱基具有如下序列：

5’-S₁N₁N₂N₃-3’

3’-S₂N₄N₅N₆-5’；

所述S₁为限制性内切酶的识别序列的正向序列，所述S₂为限制性内切酶的识别序列的反向序列，所述N₁、N₂为目的DNA 3’末端两个碱基的反向互补序列，N₃-N₆为目的DNA的碱基，所述酶切位点位于N₂和N₃之间以及S₂和N₄之间。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的酶切位点序列还含有保护碱基序列，其中S₁的5’端具有保护碱基序列1，S₂的3’端具有保护碱基序列2，保护碱基序列1与保护碱基序列2反向互补；较佳地，所述的保护碱基序列为含有3-6个碱基的GC含量高的序列；更佳地，所述的保护碱基序列1为：GCGC、GGGC或者CCCG。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的限制性内切酶为BseGI、BstF5I或BtsCI酶，所述的S₁序列为GGATG，S₂序列为CCTAC；

或者，所述的限制性内切酶为BtsαI或BtsI酶，所述的S₁序列为GCAGTG，S₂序列为CGTCAC；

或者，所述的限制性内切酶为BtsIMutI酶，所述的S₁序列为CAGTG，S₂序列为GTCAC；

或者，所述限制性内切酶为Bse3DI、BseMI或者BsrDI酶，所述的S₁序列为GCAATG，S₂序列为CGTTAC。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的限制性内切酶为BseGI，茎环结构前体序列为：5'-GCGCGGATG+N₁N₂+目的DNA+CATCCGCGC-3'；

和/或，步骤(2)所述的缓冲液包含下列组分：MgCl₂ 5mM，Tris-HCl 10mM，DNA 10μM；pH8.0。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的退火处理为：热循环仪95℃处理5分钟，然后迅速降温至4℃，并保持10分钟；

和/或，步骤(3)所述的限制性内切酶处理为33-38℃处理12小时以上，所述的限制性内切酶的酶活单位为8-15U；较佳地为37℃处理12小时，所述限制性内切酶的酶活单位为10U。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的使限制性内切酶失活为60-68℃处理茎环结构溶液15-25分钟；较佳地为65℃处理茎环结构溶液20分钟。