[发明专利]一种5`端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用。该制备方法包括如下步骤：(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体；(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。本发明制备方法步骤简单、成本低廉，磷酸化效率高，所得5'端磷酸化单链DNA易于表征和纯化，将其应用于基因编辑、靶向定位和/或调控可以显著提高效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种5'端磷酸化单链DNA(5'P-ssDNA)的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，以CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)技术为代表的新一代基因编辑技术由于其精准的靶向性和易用性，在生物学基础研究和生物医学应用中已经展现出不可估量的潜力。这类基因编辑系统通常利用了细菌中天然存在的防御机制，实现对入侵DNA的靶向剪切。除了CRISPR系统的Cas9系列限制性内切酶(也简称内切酶)之外，一些基于其他内切酶(例如Argonaute)的基因编辑系统也受到了广泛的关注。该类内切酶采用5'磷酸化的单链DNA作为引导(guide DNA，gDNA)来帮助核酸酶识别目标基因序列并对其进行剪切。与CRISPR系统相比，这类系统采用短单链DNA而非RNA作为引导分子，无需构建用于RNA表达的质粒，更加易于人工合成和直接转染。目前，商业化的单链DNA化学合成技术已经非常成熟且价格低廉，使得利用单链DNA(ssDNA)作为引导的基因编辑系统在成本上比利用RNA的CRISPR系统更有优势。更重要的是，常规的CRISPR系统要求目标区域下游具有特定的PAM序列，而Argonaute系统无类似限制，几乎可用于针对任何目标序列。

但是，与天然的DNA末端不同，默认条件合成的单链DNA 5'端没有引入磷酸基团。为了获得可用于基因编辑系统的引导DNA，我们需要对化学合成的单链DNA进行合成后的5'端磷酸化修饰。因此，磷酸化的效率就成为了影响基因编辑效率的关键因素之一。目前已有的某些研究表明，由商业化的引物合成服务提供的化学磷酸化修饰方法所获得的5'-PssDNA在基因编辑应用当中对目标基因的剪切效率不佳，而用T4核酸激酶催化的磷酸化修饰也存在效率难以优化、修饰产物难以表征和纯化的问题。

此外，基因工程中常用的经典DNA限制性内切酶催化的剪切反应通常识别并作用于DNA双链，剪切产物也是双链，因此不适合直接用于单链DNA的5'磷酸化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的磷酸化效率低、剪切效率不佳等困难提供一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用。该制备方法具有操作简便、磷酸化效率高、适用范围广以及应用前景广阔等优点。

本发明解决上述问题的技术方案之一是：一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法，其包括如下步骤：

(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的DNA位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；

(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；

(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；

(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。