[发明专利]一种脂肪干细胞分离培养方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，包括：

S1，洗涤脂肪组织，除去血细胞，向T175培养瓶中加入50ml脂肪组织、100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5min，使不同相分离，吸去下层水相，重复S1步骤三次，直到下层液较为清澈；

S2，I型胶原酶消化，加入0.1％预热的I型胶原酶溶液，封口，剧烈晃动T175培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15min剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到脂肪组织看起来较为平滑；

S3，分离脂肪基质血管组分，将消化后的脂肪组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温下400g离心10min，得到的沉淀即为脂肪基质血管组分；

S4，净化沉淀，离心后，脂肪基质血管组分沉积于离心管底部，用移液管自上而下除去上层油脂和下层的胶原酶溶液，再加入适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g离心10min，离心完毕，再次吸取上层清液，最后加入10ml培养基悬浮细胞，将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次在室温下，300g离心10min；

S5，细胞种植，离心后加20ml培养基充分混匀，按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量，每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶，进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞；

S6，细胞培养，将T75培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，原代培养第24h后，进行全量换液，此后每隔3天全量换液，并且保持在二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养；

S7，原代细胞收获，7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，收获原代细胞，在T75培养瓶中每75cm²加入2ml由125％Trypsin～0.01％EDTA组成的消化酶溶液，消化1.5～2.5min，再加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,将脱落下来的原细胞移入50ml离心管中，并往原T75培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，最终加入50ml离心管中并定容至50ml，使用移液管吹打悬浮后，通过100目无菌滤网过滤，过滤液收集到另一个50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤；

S8，原代细胞传代，观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数，计数后进行1000rpm，10min二次离心，去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵个cells/T75，在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息，将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养，直至培养至细胞融合达85％～90％。

2.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于：在S1步骤中，T175培养瓶需用75％的酒精擦拭外壁。

3.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于：在S2步骤中，I型胶原酶溶液的预热方法为提前半小时于37℃的气浴摇床预热。

4.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于：在S4步骤中，移液管吸取下层的胶原酶溶液时，需要在脂肪基质血管组分沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。

5.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于：在S6、S8步骤中，培养箱中温度为37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。

6.如权利要求1所述的脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于：在S4至S8步骤中，所述培养基为Media31+GF30。