[发明专利]一种脂肪干细胞分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及脂肪干细胞分离培养领域，尤其涉及一种脂肪干细胞分离培养方法。

背景技术

干细胞储存业务从单纯的脐带血储存发展到现今的脐带、胎盘、牙齿等多种来源的干细胞储存，其重要性和必要性已经为越来越多的人所认可。对于临床研究来说，干细胞应用于临床实践目前主要是从骨髓系统中分离纯化造血干细胞，但骨髓干细胞在获取过程中，骨穿异常疼痛，并且获取细胞数量少。而脂肪干细胞具有来源广泛，易获得，患者痛苦小，细胞量充足等优点，但是目前对于脂肪干细胞的培养，却缺乏一套完整的体系，脂肪干细胞的培养效果并不理想。

发明内容

为了解决上述不足，本发明提供一种脂肪干细胞分离培养方法，通过建立一套完整的脂肪干细胞分离培养体系，提高脂肪干细胞的培养效率，其技术方案如下：

S1，洗涤脂肪组织，除去血细胞，向T175培养瓶中加入50ml脂肪组织、100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5min，使不同相分离，吸去下层水相，重复S1步骤三次，直到下层液较为清澈；

S2，I型胶原酶消化，加入0.1％预热的I型胶原酶溶液，封口，剧烈晃动T175培养瓶5～10s，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15min剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到脂肪组织看起来较为平滑；

S3，分离脂肪基质血管组分，将消化后的脂肪组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温下400g离心10min，得到的沉淀即为脂肪基质血管组分；

S4，净化沉淀，离心后，脂肪基质血管组分沉积于离心管底部，用移液管自上而下除去上层油脂和下层的胶原酶溶液，再加入适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g离心10min，离心完毕，再次吸取上层清液，最后加入10ml培养基悬浮细胞，将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次在室温下，300g离心10min；

S5，细胞种植，离心后加20ml培养基充分混匀，按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量，每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶，进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞；

S6，细胞培养，将T75培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，原代培养第24h后，进行全量换液，此后每隔3天全量换液，并且保持在二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养；

S7，原代细胞收获，7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，收获原代细胞，在T75培养瓶中每75cm²加入2ml由125％Trypsin～0.01％EDTA组成的消化酶溶液，消化1.5～2.5min，再加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,将脱落下来的原细胞移入50ml离心管中，并往原T75培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，最终加入50ml离心管中并定容至50ml，使用移液管吹打悬浮后，通过100目无菌滤网过滤，过滤液收集到另一个50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤；

S8，原代细胞传代，观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数，计数后进行1000rpm，10min二次离心，去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm²，即(3.75～4.5)×10⁵个cells/T75，在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息，将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养，直至培养至细胞融合达85％～90％。

进一步，在S1步骤中，T175培养瓶需用75％的酒精擦拭外壁。

进一步，在S2步骤中，I型胶原酶溶液的预热方法为提前半小时于37℃的气浴摇床预热。

进一步，在S4步骤中，移液管吸取下层的胶原酶溶液时，需要在脂肪基质血管组分沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。

进一步，在S6、S8步骤中，培养箱中温度为37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。

进一步，在S4至S8步骤中，所述培养基为Media31+GF30。