[发明专利]CHO细胞高效表达TD‑bFGF融合蛋白的构建方法和应用

权利要求书

1.一种融合蛋白TD-bFGF，其特征在于：所述融合蛋白TD-bFGF的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者与SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，所述同一性为至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于，在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc、MPG、VP22、TD34、TD、Tat48-60和/或Tat47-57。

4.与所述融合蛋白TD-bFGF相关的生物材料，为下述B1）-B5）中至少一种：

B1）编码上述融合蛋白TD-bFGF的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，例如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子或是RNA，例如mRNA或hnRNA。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子为如下1）-4）中任一所示的基因：

1）核酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子或cDNA分子；

2）编码序列是SEQ ID No.1第11-613位所示的DNA分子或cDNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有75%以上同一性，且编码所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）中任一所述限定的DNA分子杂交，且编码所述融合蛋白TD-bFGF的DNA分子或cDNA分子。

7.权利要求1-4任意一项所述融合蛋白TD-bFGF的制备方法，包括：

(1) 将合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；

(2) 用转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；

(3) 用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因的稳定转染细胞株；

(4) 通过SDS-PAGE电泳筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；

(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株；

(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量；

(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白换液至PBS溶液中；再用缓冲液上离子柱纯化液，获得纯的目的蛋白；

(8) 经膜包置换至PBS缓冲液中，通过创伤测定和安全试验进行评价。

8.权利要求1-3任意一项所述融合蛋白TD-bFGF在制备皮肤涂抹或喷雾制剂中的应用。

9.权利要求1-3任意一项所述融合蛋白TD-bFGF在制备化妆品中的应用。

10.一种皮肤涂抹或喷雾制剂，其特征在于，含有权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白TD-bFGF。

11.含有权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白TD-bFGF与其他蛋白质融合方法。