[发明专利]CHO细胞高效表达TD‑bFGF融合蛋白的构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的融合细胞因子生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建CHO细胞高效表达bFGF融合蛋白的方法和应用。

背景技术

药物透皮给药系统（Transdermal therapeutic system, TTS或Transdermal delivery, TDS）是指在皮肤表面给药，药物以恒定速度（或者接近恒定速度）通过皮肤各层，进入体循环，产生全身或局部治疗作用的新型给药方式。透皮给药相对于传统的口服与皮下静脉注射方式而言，其具有方便性、可持续性和可控制性等优点，能通过简单混合涂抹或喷雾给药方式促进bFGF等大分子蛋白质药物进入动物血液循环发挥其治疗效果。

用基因工程的方法制备的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）是具有多功能的细胞生长因子，由146个氨基酸组成，分子量为16.4KD的活性多肽，对促进成纤维细胞等多种细胞的生长发挥着重要的作用。临床研究证明，bFGF能快速愈合皮肤创伤、更新皮肤细胞组成；能促进微血管的生成；增加皮肤弹性、维护皮肤正常新陈代谢、改善皮肤微环境具有重要的意义。bFGF是在分子水平上对细胞进行修复和调整，如促进皮肤细胞的生长，预防皮肤受到各种损伤，调节细胞中色素的平衡等，再创建皮肤的最佳结构和状态，从根本上达到保健皮肤、延缓衰老的目标。但是涂抹该蛋白皮肤吸收效率低。尽管目前市场上已有大肠杆菌和酵母等表达的bFGF基因产品的供应，但人们仍在寻求新的低成本的高效bFGF制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细（ChineseHamster Ovary Cell，简称CHO）是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

本发明将一种透皮肽片段和细胞因子bFGF蛋白融合，其氨基酸序列从N端到C端依次包括透皮肽片段、柔性肽接头和细胞因子bFGF。与现有bFGF相比，TD-bFGF融合蛋白克服了在体外使用效率低且原核表达产物的不稳定缺陷，其透皮进入体内效果更好。本发明还涉及重组透皮肽和细胞因子bFGF融合蛋白组合物在化妆品上的用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高现有bFGF蛋白质在大肠杆菌表达效果差、使用时活性低和透皮肽原核内毒素残留引起皮肤过敏等问题。为了解决上述技术问题，本申请人提供了一种稳定高效表达透皮肽片段和bFGF融合蛋白的CHO细胞株的构建方法。本发明分别获得的可以分泌表达TD-bFGF的单克隆细胞株，经分离纯化获得该融合蛋白。所述TD-bFGF融合蛋白能透过皮肤，比市面产品活性要高，可用于化妆品皮肤药物，具有降低生产成本和提高bFGF作用的效果。

本发明的技术方案如下

本发明设计了一种重组bFGF蛋白在中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamsterovary, CHO）中构建方法，主要包括以下几点：

(1) 将合成的透皮肽片段和bFGF的融合基因连接入真核质粒载体构建真核表达质粒；

(2) 用转染的方法将真核表达质粒转染至CHO细胞株中；

(3) 用含G418的选择培养基筛选整合入融合基因的稳定转染细胞株；

(4) 通过SDS-PAGE电泳筛选出能够高效表达融合蛋白的阳性克隆株；

(5) 进行重复低密度铺板克隆筛后获得稳定且融合蛋白表达量最高的阳性CHO单克隆细胞株；

(6) 将筛选得到的稳定表达融合蛋白阳性克隆株进行悬浮驯化与发酵；用SDS-PAGE电泳方法检测收集蛋白液中融合蛋白的表达量；

(7) 收集发酵液进行蛋白纯化，先通过HIS亲和柱纯化融合蛋白并除去大部分的杂蛋白，上样除去部分杂蛋白并将目的蛋白换液至PBS溶液中；再用缓冲液上离子柱纯化液，获得纯的目的蛋白；

(8) 经膜包置换至PBS缓冲液中，根据生物制品，利用进行评价。

本发明所提供的融合蛋白TD-bFGF，其特征在于：所述融合蛋白TD-bFGF的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者与SEQ ID No.2所示序列具有至少75%的同一性。