[发明专利]一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱由8对SSR标记组成，具体序列如下：

1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；

反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；

76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；

反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；

43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；

反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；

16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；

反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；

19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；

反向引物：TCTGTAACGCTTGTGGACTA；

148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

反向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；

反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；

192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；

反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC；

所述菌种的带型编号组合为：(1+2)(2+4+5)(3)(1)(2+3)(1+4)(1+4)(1+2+3+4)。

2.一种如权利要求1所述的香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：

(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；

(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；

(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。

3.根据权利要求2所述的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：

(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；

(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；

(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL 1×TE缓冲液，使沉淀溶解；

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。

4.根据权利要求2所述的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。