[发明专利]一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用。

背景技术

我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2015年的766万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。

优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。

面对这种局势，就需要进一步加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。

本发明的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由8对SSR标记组成。SSR标记是基于香菇全基因组测序后开发的简单重复序列片段(SSR)的扩增引物，经过对不同香菇品种进行PCR扩增后获得的多态性标记。SSR标记具有扩增带型好，重复性高的特点。本发明对大量的SSR引物进行了筛选，获得了8对多态性高的引物，用这8对引物组合获得的图谱带型，检测目前我国主要栽培的40个香菇品种大多都具有专一性。这8对SSR标记的详细信息如表1。

表1SSR标记详细信息列表

本发明的一种香菇申香12号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，包括：

(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基PDB中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-4d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀，变性，点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，显色，拍照，分析结果。

所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：

(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，轻摇混匀；

(2)12000rpm、4℃离心20min，取上清液；

(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

(5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

(6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；

(7)加入预冷的95vol％乙醇，上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)缓冲液，使沉淀溶解；

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。