[发明专利]一种用于生发的注射液及其制备方法

权利要求书

1.一种用于生发的注射液，其特征在于，由毛囊干细胞、毛乳头细胞、适量赋形剂和水组成，其中，每100ul注射液中含有1×10⁶以上个毛囊干细胞和1×10⁶以上个毛乳头细胞。

2.根据权利要求1所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。

3.根据权利要求2所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原和硫酸软骨素。

4.根据权利要求3所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述胶原为IV型胶原。

5.根据权利要求1所述的用于生发的注射液，其特征在于，制备方法为：

一、分离毛乳头细胞和毛囊干细胞

取美容手术中多余的正常的头皮组织，用含抗生素的PBS反复冲洗，用剪刀去除头皮组织的皮下脂肪，并将毛乳头剪下放入预先铺有IV型胶原的培养皿中，将头皮组织剪成宽2-3mm的条状，将剪好的头皮组织浸泡在0.25％的中性蛋白酶中，4℃过夜，次日取出，然后用PBS冲洗，再用摄子小心将毛发从头皮组织中拔出，置于预先铺有IV型胶原、盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中；

二、培养毛乳头细胞

向放有毛乳头的培养皿中加入5ml 0.2％II型胶原酶，在37℃孵箱内消化1h，并不时摇动，观察到液体变浑浊、真皮鞘变软后取出，用吸管反复吹打使毛乳头游离，加入PBS进行离心，先以2000rmp离心5min，反复4遍，再以800rmp离心4min，反复3遍，离心完成后弃上清，取沉淀，向沉淀中加入含10％FBS的DMEM培养基，重悬，接种到培养瓶中，放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，再用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到含10％FBS的DMEM培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛乳头细胞培养物；

三、培养毛囊干细胞

在解剖显微镜下去除毛囊上段与下段，收集毛囊中段，在37℃条件下用胰蛋白酶消化毛囊中段30-45min，消化结束后用10％FBS培养基中和，再400目筛网过滤，将滤液离心，弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以5×10⁴/cm²的密度将细胞接种在预铺有IV型胶原并且盛有DMEM但是未添加FBS的培养皿中，30min后弃上清及未贴壁的细胞，用PBS小心冲洗，重新加入到K-SFM无血清培养基中，然后放于37℃恒温培养箱中培养，每三天换液一次，当细胞融合达到90％后，吸取培养基，用无菌PBS清洗两遍，胰酶消化2min，完全培养基中和终止消化，离心后弃上清，将沉淀物加入到K-SFM无血清培养基中，以1：3比例传代培养，培养至第5代，得到毛囊干细胞培养物；

四、制成注射液

将培养至第5代的毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将沉淀物用完全培养基重悬，并用细胞计数板计数，将毛囊干细胞和毛乳头细胞转移至另一离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，向沉淀物中加入适量体积的悬液，使100ul注射液中含有1×10⁶以上个毛囊干细胞和1×10⁶以上个毛乳头细胞，所述悬液是赋形剂的水溶液。

6.根据权利要求5所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自胶原、纤维蛋白原、热逆变水凝胶、原位交联的水凝胶、化学交联的可生物吸收的聚合物、凝血酶、淀粉、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、多糖、蛋白质、以及上述的任何衍生物共聚物或其它变体及其它药学上可接受的赋形剂。

7.根据权利要求6所述的用于生发的注射液，其特征在于，所述赋形剂选自IV型胶原和硫酸软骨素，将100mg的IV型胶原和100mg的硫酸软骨素溶解在100ml蒸馏水中，配制成悬液。