[发明专利]用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程领域，具体涉及用于HIV感染治疗的多核苷酸及其制备药物应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染所引起的免疫系统疾病，是一种危害性极大的全球化传染病。HIV以人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击对象，造成免疫功能丧失，从而易患各种疾病，死亡率高达99％-100％。HIV在人体内的潜伏期能长达8-10年，很多HIV感染者在发展成艾滋病患者之前可以无病症的生活，但病毒在人体内始终存在并不可治愈。虽然全世界众多医学研究人员专注于艾滋病的预防和治疗，但至今尚未研制出特效药物，由于HIV的变异极其迅速，因此也还没有可用于预防的有效疫苗。

对于HIV感染的治疗，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒载量、获得免疫功能重建和维持免疫功能、提高生活质量，以及降低HIV相关的发病率和死亡率。抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy，ART)是近年来广泛使用的治疗手段，它有效抑制HIV在体内的复制，减少体内病毒载量，从而延长感染者的寿命，但其花费高昂，患者依从性差，长期治疗容易产生副作用和抗药性，并且一旦中止治疗病情可能快速反弹，最重要的是，ART并不能够根除体内的HIV病毒，达不到根治的效果。而以基因为基础的治疗方法可以持续的抑制病毒从而减少治疗干预措施，是一种非常有前景的治疗方式。

对HIV感染基因治疗手段的发展经历了两个阶段。一，基于RNA的治疗方法，即一种下调相关基因表达量的方法，如shRNA、siRNA、反义RNA等。复旦大学(201110182785.5)公开了一种携带特定RNAi核苷酸片段的重组慢病毒表达载体以及在此基础上构建的重组慢病毒及其制备方法，可以应用于艾滋病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。武汉大学(200910062851.8)公开了一种多靶点siRNA重组慢病毒载体，其中针对CCR5和HIV保守基因rev和tat的三靶点siRNA重组慢病毒载体具有最佳的抑制HIV病毒复制的能力，并能克服或延缓病毒逃逸。但上述技术只能达到基因沉默的效果，不能彻底的将基因敲除。二，基于蛋白质的治疗方法，即对相关基因的敲除，如ZFN(Zinc Finger Nuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-like Effector Nuclease)等。清华大学和北京唯尚立德生物科技有限公司共同申请的专利(201210385677.2)公开了一类调控CCR5和CXCR4的融合蛋白及方法，该方法利用TALEN技术靶向剪切CCR5或CXCR4基因的活性区域，使经过基因编辑后的细胞具备抵御HIV的能力。中国科学院广州生物医药与健康研究院和呼吸疾病国家重点实验室对CCR5缺失型的造血干细胞及其制备方法与应用提出专利申请(201110115680.8)，该技术通过ZFN来失活人诱导多潜能干细胞的CCR5基因，再经过体外定向诱导分化得到CCR5缺失型的造血干细胞。然而TALEN和ZFN基因编辑系统较为复杂，突变效率较低^[1]，已经逐步被CRISPR/Cas9技术所代替。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR-associated endonuclease)系统是基因治疗领域的新成员，是一款强大的基因编辑工具。有别于ZFN和TALEN需要研究者根据目的基因设计和生产一对特异性的核酸酶，CRISPR更简单，具有更广泛的适应性。CRISPR系统由一段crRNA和tracrRNA的嵌合体(crRNA-tracrRNA chimera)和一个Ⅱ类CRISPR系统的非特异性的内切核酸酶9(Cas9)组成，其中的RNA嵌合体由一段Cas9绑定序列gRNA scaffold和一段20nt左右的靶向结合目的基因/位点的RNA向导序列(guide RNA，gRNA，或称引导RNA)构成。只要根据目的基因设计特异性的gRNA序列，即可引导Cas9在靶位点附近进行切割，产生双链断裂(double strand break,DSB)，然后细胞通过容易产生插入/缺失突变的非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)将其修复，从而破坏目的基因的开放阅读框，达到敲除基因的目的。