[发明专利]一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为2万/mL-20万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为75％(v/v)-90％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭3-5次，弃去前2-3把乳汁，然后将乳汁直接挤入400mL-800mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；

(2)分离水牛乳汁：水牛乳汁经过第一次、第二次离心分离获得水牛乳腺上皮细胞；所述第一次离心分离方法为：将步骤(1)的新鲜水牛乳汁与A培养液按体积比为1-2:1混合均匀后进行第一次离心，离心后除去上层半凝固状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余4mL-5mL停止，完成第一次离心分离，得到第一次离心剩余混合物；所述第二次离心分离方法为：将第一次离心剩余混合物与A培养液按体积比为1-2:1的比例重悬后进行第二次离心，离心后除去上层环状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余0.5mL-1.5mL停止，完成第二次离心分离，得到第二次离心分离剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化：将步骤(2)第二次离心分离剩余混合物接种于含有5mL-8mLB培养液的培养皿中，接种后将培养皿放在温度为35℃-37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，11h-13h后，观察培养皿内的液体，取液体外观呈粉红浑浊状且无蜡样物质的培养皿，将磷酸缓冲盐溶液加入培养皿中对培养皿内的液体进行清洗直至液体由粉红浑浊状转为澄清透明；然后再加入4mL的B培养液，然后每两天更换一次B培养液，培养至第6d时，将培养皿放在显微镜下观察、并刮除培养皿内的非乳腺上皮细胞并去除培养皿内的B培养液，再用磷酸缓冲盐溶液对去B培养液后的液体进行清洗3次-5次，清洗后将培养皿放在温度为35℃-37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，继续观察，直至细胞的融合度为80％时，将细胞进行消化传代或冻存；

所述A培养液为：含有0.1mg/mL-0.15mg/mL青霉素和0.05mg/mL-0.1mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所述B培养液由以下方法制得：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为8-9：1混匀，然后加入1mmol/L-1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L-0.5mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U-150U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U-150U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL-1.5μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL-1.5μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL-10μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL-10μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL-15ng/mL表皮细胞生长因子；

所述B培养液中非必需氨基酸由以下物质组成：0.1mmol/L-0.3mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丝氨酸；

所述B培养液中的抗氧化剂为β-巯基乙醇或中药抗氧化剂；

所述中药抗氧化剂由同等质量份的王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠组成；所述中药抗氧化剂由以下方法制得：将所述中药材混合后加入与混合物同等质量比的蒸馏水煮沸，然后转文火进行煎煮60min-70min，再进行过滤，取滤液进行浓缩直至生药含量为0.2g/mL-0.4g/mL，再进行离心，取离心之后的上清液调节pH值为7.5，然后再用微孔滤膜进行过滤、除菌、冷却至2℃-4℃制得中药抗氧化剂；所述离心条件为：离心转速为2000r/min-3000r/min，离心温度为室温，离心时间为10min-20min。