[发明专利]一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，本发明的方法主要包括(1)收集水牛乳汁、(2)分离水牛乳汁和(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化几个步骤来完成，本发明分离水牛乳腺上皮细胞的材料为水牛乳汁，采集方式为人工挤奶，取材方便，经济便捷，通过合理配置培养液、合理操作能高效的分离水牛的乳腺上皮细胞，减少细胞损伤；同时，在培养基中添加非必需氨基酸和抗氧化剂，非必需氨基酸能够促进水牛乳腺上皮细胞的增殖，抗氧化剂能够提高乳腺上皮细胞抗氧化酶活性，增强了细胞的抗氧化能力，从而促进细胞生长，提高细胞活力。

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法。

【背景技术】

荷斯坦奶牛乳汁固体物(蛋白质、脂肪、矿物质)含量为13-16％，而水牛乳汁高达18-23％；水牛奶的乳脂率平均为8.5％，是荷斯坦牛奶的2倍多，通过长期选育，虽然水牛的产奶量有了很大的提高，但是仍旧远远低于荷斯坦奶牛，因此，乳腺生物学及泌乳功能的基础性研究对提高水牛的产奶量具有十分重要的意义。但是，目前仍旧没有成熟的商品化水牛乳腺上皮细胞，只能通过原代分离的方法获得。奶牛的原代乳腺上皮细胞分离的方法有4种，分别为组织块贴壁法、酶消化法、机械剪切法和乳汁分离法，目前，水牛乳腺上皮细胞已通过组织块贴壁法、胰酶消化法和机械剪切法成功分离，但是，组织块贴壁法、胰酶消化法和机械剪切法都需要水牛乳腺组织，而水牛乳腺组织的获得主要有两种途径，一种通过对健康高产奶水牛进行穿刺或手术，另一种取自屠宰场。前者可以选择供体水牛，但对水牛有伤害，经济成本高；后者水牛一般为淘汰母牛，其生产性能和生理状态都较差，不能排除是否患有乳腺炎，严重影响细胞的分离。且此三种分离方法在分离过程中对细胞损伤较大。

目前，利用乳汁分离法分离乳腺上皮细胞的研究，主要还是在奶牛乳汁中进行，对水牛乳汁的乳腺上皮细胞分离未见相关报道，例如，申请号为201410412690.1的中国专利，公开了从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基,该方法主要是对奶牛乳汁进行乳腺上皮细胞进行分离；又例如，《生物技术通报》2013年第3期第107-113页，《牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定》一文中也指出了从奶牛乳汁纯化分离和培养乳腺上皮细胞，但是，目前还没有关于从水牛乳汁中直接分离培养水牛乳腺上皮细胞的报道，而且，也没有公开如何培养可以提高水牛乳腺上皮细胞的存活率；水牛乳汁中的固体物比奶牛乳汁中的固体物含量要多，乳脂率更大，乳汁中含有更多的脂肪，乳腺上皮细胞含量少，因此，分离乳腺上皮细胞的难度更大，由于水牛的乳腺上皮细胞在水牛乳汁中含量少，因此，体外培养时如何进行分离、避免细胞氧化损伤，提高细胞活力也成了水牛乳腺上皮细胞培养必须解决的技术难题。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，能有效的从水牛乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞，同时还能提高乳腺上皮细胞在体外培养时的活力，避免细胞损伤。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为2万/mL-20万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为75％(v/v)-90％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭3-5次，弃去前2-3把乳汁，然后将乳汁直接挤入400mL-800mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；