[发明专利]孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法

权利要求书

1.孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(一)提取孢子丝菌总DNA；

(二)克隆孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列至载体p-EGFP-N1的gfp基因尾部，制备重组质粒p-EGFP-N1-t：

2.1)以DNA为模板，以特异性引物Au和Ad进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的PCR产物；

所述的特异性引物Au：gcggcggccgcTAGGGACAAGGACCTCCAC

所述的特异性引物Ad：gcgtctagactagtGTAGTAAACAATCAAAACCAGTG

所述的孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2.2)将PCR产物和p-EGFP-N1载体分别用NotI和XbaI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p-EGFP-N1连接；

2.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p-EGFP-N1-t；

(三)克隆孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列至重组质粒p-EGFP-N1-t的gfp基因前部，制备重组质粒p-EGFP-N1-p-t：

3.1)以DNA为模板，以特异性引物Qu和Qd进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的PCR产物；

所述的特异性引物Qu：gcggagctcGCGAATGGACAGAGGTAAGT

所述的特异性引物Qd：gcgggatccTGTTGAAAGAGGGTAAACGGAG

所述的孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3.2)将PCR产物和p-EGFP-N1-t分别用SacI和BamHI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p-EGFP-N1-t连接；

3.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p-EGFP-N1-p-t；

(四)构建PCB309-pSsDRK1-yEGFP-tSsDRK1重组质粒：

通过SacI和speI双酶切重组质粒p-EGFP-N1-p-t和载体PCB309，将双酶切后的产物进行连接，构建PCB309-pSsDRK1-yEGFP-tSsDRK1重组质粒；

(五)构建孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株：

将PCB309-pSsDRK1-yEGFP-tSsDRK1重组质粒转化根癌农杆菌感受态细胞中，再将含有PCB309-pSsDRK1-yEGFP-tSsDRK1的根癌农杆菌与孢子丝菌混合，将PCB309-pSsDRK1-yEGFP-tSsDRK1转入孢子丝菌中，获得孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株。

2.根据权利要求1所述的孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法，其特征在于：

步骤(二)具体为：

2.1)以DNA为模板，以特异性引物Au和Ad进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的PCR产物；

反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃10min；

2.2)将PCR产物和p-EGFP-N1载体分别用NotI和XbaI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p-EGFP-N1连接；

酶切温度：37℃，时间：3h；

连接温度：22℃，时间：2h；

2.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p-EGFP-N1-t。