[发明专利]孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌报告菌株构建领域。具体涉及孢子丝菌DRK1基因启动子的获得、DRK1基因终止子的获得、重组载体PCB309-PGFPT的构建、用于转染的根癌农杆菌及孢子丝菌。

背景技术

孢子丝菌病是由申克孢子丝菌及其复合体引起的皮肤、皮下组织及附近淋巴管的慢性感染性疾病，是最常见的皮肤深部真菌病。随着宠物饲养及免疫受损人群数量的增多，本病的发病率不断攀升，并出现局部区域的爆发流行。孢子丝菌病在全球范围内广泛分布，我国为该病的高发地区，2008-2013年间仅一家医院就接诊孢子丝菌病患者1500余例，严重危害民众健康。

孢子丝菌属于双相病原真菌，此类真菌在自然环境中呈腐生状态生长，无致病性，入侵宿主后其生存环境发生骤变，菌体为适应变化的温度，碳源，偏酸或中性的PH值以及缺氧、高二氧化碳的生存环境不得不发生形态转换，转呈寄生状态生长，并形成致病性。大量研究证实处于信号转导通路上游位置的双组分信号系统在双相真菌适应体内的高渗透压及氧化刺激、形态转化、细胞壁生物合成以及毒力、致病性形成等方面发挥重要作用。双组分信号系统广泛存在于荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、马内菲青霉菌、白念珠菌等多种病原真菌体内，而人类细胞中尚未发现该信号转导系统的存在，因此，探明真菌双组分信号转导系统的机制可为抑制物的设计和寻找提供多个靶点，针对这些靶点研发的新型抗真菌药物将有效地抑制病原真菌的生长而不对宿主细胞造成损伤。近年，病原真菌双组份信号转导系统中组氨酸蛋白基因受到了学者的广泛关注，白念珠菌组氨酸蛋白激酶CaHK1/CaNIK1/CaCOS1/CaSLN1、粗糙脉胞霉菌组氨酸蛋白激酶NIK-1、皮炎芽生菌组氨酸蛋白酶DRK1、荚膜组织胞浆菌组氨酸蛋白酶DRK1相继被鉴定出来，并被证实为调控真菌致病性的形成及毒力蛋白表达的关键基因。

与其他双相真菌病相比，孢子丝菌病发病率最高，病原菌的毒力相对较弱，具有很好的实验安全性，并因大多仅感染皮肤和皮下组织而便于观察的特点可望成为双相真菌病防治研究的突破点。先前研究已经证实孢子丝菌双组份信号系统组氨酸蛋白激酶DRK1基因的存在，并对其进行克隆、结构功能域预测及致病性的鉴定。所以对其功能进行更深入的研究、并以其为靶点开发崭新的抗真菌药物及治疗方法，具有崭新的意义。

发明内容

本发明的目的是构建一种孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株，以绿色荧光蛋白表达情况来示踪DRK1的表达水平，从而对DRK1基因的表达做到更加便捷、准确的监测。

本发明采用的技术方案是：孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法，包括如下步骤：

(一)提取孢子丝菌总DNA；

(二)克隆孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列至p-EGFP-N1载体的gfp基因尾部，制备重组质粒p-EGFP-N1-t：

2.1)以DNA为模板，以特异性引物Au和Ad进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的PCR产物；

所述的特异性引物Au：gcggcggccgcTAGGGACAAGGACCTCCAC

所述的特异性引物Ad：gcgtctagactagtGTAGTAAACAATCAAAACCAGTG

所述的孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2.2)将PCR产物和p-EGFP-N1载体分别用NotI和XbaI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p-EGFP-N1连接；

2.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p-EGFP-N1-t；

(三)克隆孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列至重组质粒p-EGFP-N1-t的gfp基因前部，制备重组质粒p-EGFP-N1-p-t：

3.1)以DNA为模板，以特异性引物Qu和Qd进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的PCR产物；

所述的特异性引物Qu：gcggagctcGCGAATGGACAGAGGTAAGT

所述的特异性引物Qd：gcgggatccTGTTGAAAGAGGGTAAACGGAG

所述的孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3.2)将PCR产物和p-EGFP-N1-t分别用SacI和BamHI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p-EGFP-N1-t连接；