[发明专利]一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法

权利要求书

1.一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其特征在于所述构建方法步骤如下：

一、以大麻花期叶片、雄花、雌花混合样为材料，提取总RNA；

二、反转录为cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

三、以反转录产物为模板，设计特异性引物，用Taq酶对反转录产物进行PCR反应，获得PCR产物并回收；

四、将经Sal Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切的THCA合成酶基因正向片段与Sal Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切pSKint载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由Sal Ⅰ/HindⅢ双酶切进一步鉴定得到pSKTHCAihp Ⅰ；

五、pSKTHCAihp Ⅰ经BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切与经BamH Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切的THCA合成酶基因反向片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切进一步鉴定得到pSKihpTHCA；

六、胶回收获得含有正反向THCA合成酶基因和内含子的片段，与经Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切pCAMBIAsuper1300+植物表达载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定，Sal Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切进一步鉴定，植物表达载体pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA构建成功。

2.根据权利要求1所述的大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其特征在于所述步骤一中，利用TRIzol提取液抽提RNA。

3.根据权利要求1所述的大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其特征在于所述步骤三中，引物序列如下：

正向序列：酶切位点Sal Ⅰ和Hind Ⅲ

THCAihp Ⅰ SalF：5’-CTAGTCGACCTCAGCATTTTCCTTTTG-3’；

THCAihp Ⅰ HinR：5’-GCCCCAAGCTTAAACTAAGATTCTCATTC-3’；

反向序列：酶切位点Sac Ⅰ和BamH Ⅰ

THCAihp Ⅱ SacF：5’-GTAGAGCTCCTCAGCATTTTCCTTTTG-3’；

THCAihp Ⅱ BamR：5’-GGCGGATCCAAACTAAGATTCTCATTC-3’。