[发明专利]一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，其步骤如下：一、提取总RNA；二、反转录为cDNA；三、对反转录产物进行PCR反应；四、将THCA合成酶基因正向片段与pSKint载体连接，转化，提取质粒，酶切鉴定得到pSKTHCAihp Ⅰ；五、pSKTHCAihp Ⅰ与THCA合成酶基因反向片段进行连接，转化，提取质粒，酶切鉴定得到pSKihpTHCA；六、含有正反向THCA合成酶基因和内含子的片段与pCAMBIAsuper1300+植物表达载体进行连接，转化，提取质粒，双酶切鉴定得到植物表达载体pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA。本发明填补大麻RNAi载体构建方法的空白。

技术领域

本发明涉及一种大麻RNAi载体构建方法。

背景技术

大麻(Cannabis Sativa L.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物，由于大麻中含有一种致幻成瘾的活性成分—四氢大麻酚(THC)，易被不法分子用来非法生产毒品，造成社会危害，许多国家把工业大麻也一并列为禁种作物。大麻中的THC含量是由大麻的基因(内因)决定，并和生长环境(温度、湿度、土壤条件、日照等)(外因)有关。由于栽培小环境的不同，THC含量在个体之间存在差异；如将大麻种植于有足够空间的内陆环境时，其体内THC含量显著提高。

早在1995年，人们就已经发现了THC生物合成途径中的关键酶是四氢大麻酸(THCA)合成酶，这个酶是一个分子量为74kDa的单体脱氢酶，它催化由戊基间苯二酚酸到四氢大麻酸A的氧化环化反应。采用基因敲除突变(knock-out mutation)的方法使THC生物合成途径中的一个关键酶失活，可为培育出不含THC的大麻新品系奠定基础。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)其指内源或外源双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的内源靶基因的mRNA发生特异性降解，进而抑制基因的表达，使基因沉默的现象，产生相应的功能表型缺失的现象。目前已报道了亚麻、苎麻一些麻类作物中的某些基因RNAi载体的构建，但尚未有大麻RNAi载体构建方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，以填补大麻RNAi载体构建方法的空白。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种大麻THCA合成酶基因RNAi载体的构建方法，包括如下步骤：

一、以大麻花期叶片、雄花、雌花混合样为材料，提取总RNA；

二、反转录为cDNA；

三、以反转录产物为模板，设计特异性引物，用高保真Taq酶对反转录产物进行PCR反应，获得PCR产物并回收；

四、将经SalⅠ/HindⅢ双酶切的THCA合成酶基因正向片段与SalⅠ/HindⅢ双酶切pSKint载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由SalⅠ/HindⅢ双酶切进一步鉴定得到pSKTHCAihpⅠ；

五、pSKTHCAihpⅠ经BamHⅠ/SacⅠ双酶切与经BamHⅠ/SacⅠ双酶切的THCA合成酶基因反向片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定正确的重组质粒，由SalⅠ/SacⅠ双酶切进一步鉴定得到pSKihpTHCA；

六、胶回收获得含有正反向THCA合成酶基因和内含子的片段，与经SalⅠ/SacⅠ双酶切pCAMBIAsuper1300+植物表达载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，提取菌液PCR鉴定，SalⅠ/SacⅠ双酶切进一步鉴定，植物表达载体pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA构建成功。