[发明专利]鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及由鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、由ORF136重组表达蛋白制备的多克隆抗体及其应用，进一步涉及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3，CyHV-3)，又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)，是引起鲤鱼、锦鲤及其变种高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原。该病自从1997年在欧洲发现以来，多个国家和地区都报道了由该疾病引起的鲤鱼或锦鲤暴发性死亡现象，给鲤鱼及锦鲤养殖产业带来了严重的经济损失。CyHV-3属于疱疹病毒目，异疱疹病毒科，鲤疱疹病毒属，是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长295kbp，两端为22kbp的正向重复序列，共编码164个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，包括8个重复ORF，是已知基因组最大的疱疹病毒。

目前，运用质谱学的方法已鉴定到46种病毒结构蛋白。其中，Michel等运用液相串联色谱技术在KHV-FL株中鉴定到13种囊膜蛋白、3种核衣壳蛋白、2种皮层蛋白和22种未知蛋白共40种结构蛋白。随后，Yi等通过对亚洲型KHV-GZ10和欧洲型KHV-GZ11进行质谱鉴定，将鉴定的结构蛋白增加至46种。虽然通过蛋白质质谱鉴定对CyHV-3病毒蛋白有了一定的认识，但大部分蛋白的精确定位和功能研究仍处于空白，只有少数蛋白进行了较深入的鉴定，其中，ORF81编码蛋白是研究较多的结构蛋白之一。另外，Fuchs等还对部分囊膜蛋白ORF25、ORF65、ORF99、ORF136、ORF149和主要衣壳蛋白ORF92进行了初步鉴定。

本发明选择的ORF136在亚洲型和欧洲型分离株中存在核苷酸序列差异，其完整开放阅读框长度分别为474bp和462bp，该基因可作为CyHV-3分子分型的有效工具。虽然蛋白质谱分析显示ORF136编码蛋白为结构蛋白，但未见具体的验证，其深入的功能定位还不清楚，更多相关研究仍有待开展。

虽然目前已有很多CyHV-3的检测诊断方法，但在实际广泛应用中主要还是基于分子的检测技术，血清学诊断并没有得到广泛的应用。尤其是对于潜伏感染的宿主来说，基于分子的检测并不能判断宿主体内是否存在病毒，而血清学诊断技术能弥补这个缺陷。基于免疫学的抗原检测方法的建立，需要有能特异性识别CyHV-3的抗体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种锂疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白及其制备的多克隆抗体，进一步提供所述多克隆抗体用于检测ORF136基因病毒的应用，以及多克隆抗体的制备方法。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白，其全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明在于提供一种编码鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白的核苷酸，其全长核苷酸碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

一方面，本发明提供一种多克隆抗体，其是以氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白为抗原在免疫动物中制备所得。

进一步地，本发明所述如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的一部分；其具体制备过程为将鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因进行PCR扩增后，得到重组克隆载体pMD18-T-ORF136；将重组克隆载体pMD18-T-ORF136、原核表达载体pET-32a(+)分别进行双酶切后进行连接，构建重组原核表达载体pET-32a-ORF136；将pET-32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta经IPTG诱导表达后得到如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白。

进一步地，本发明所述的多克隆抗体制备过程如下：将如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白对兔子进行皮下多点注射免疫，免疫后进行采血；将血液静置后，离心，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体。

另一方面，本发明在于提供一种本发明所述的多克隆抗体用于制备检测鲤疱疹病毒3型的免疫工具的应用。本发明所述的免疫工具包括但不限于，试剂、试剂盒、芯片或试纸。

更进一步地，本发明所述的多克隆抗体在检测、预防或治疗鲤疱疹病毒3型感染引起的相关疾病中的应用。