[发明专利]一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种猪急性传染病。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。(邓仕伟，汪勇，薛春芳。我国伪狂犬病流行现状及新特点.动物医学进展，2006,27(9)：105-107)(Tamba M,Calabrese R,Finelli E,et al.Risk factors for Aujeszky’s-disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy.Prev Vet Med,2002,54(3):203-212)。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRV Bartha-K61株，该病毒株是公认的优良疫苗株，上世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该疫苗进行防治，对猪伪狂犬病起到了很好的控制作用。

但是，自2011年以来，在我国华北、华中、华东、东北等地区的许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病的流行，发病猪场数量多，损失较大，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。通过对发病猪群组织器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科学家发现猪伪狂犬病病毒的抗原性发生了一定程度的变异，变异伪狂犬毒株对猪的致病性更强。(赵鸿远等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征.中国预防兽医学报，1008-0589(2014)07-0506-04)。

ST细胞，即猪睾丸细胞，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养，该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等，是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。

转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法，优势是工艺简单、成本低廉，然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。(陈文庆,王建超,刘华杰等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。

基于转瓶培养的弊端，悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小、成本低等优点，且避免了BVDV等外源病原污染，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。

目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面，率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应，疫苗生产企业越来越关注新工艺。

本申请人在为猪场提供疾病诊断的过程中，从送检病料中分离到一株gE基因自然缺失的变异株弱毒HZ株。我们用HZ株作为制苗用毒株，在对HZ株进行安全性、免疫原性等研究的基础上，尝试了ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬疫苗的工艺。该工艺关键技术在于细胞驯化，ST细胞全悬浮驯化成功后，可用于猪伪狂犬病毒的培养。较其它微载体悬浮培养系统，该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。

发明内容

本发明的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬病疫苗的工艺，从而降低生产成本，进行规模化、均一性生产，以应对目前国内猪伪狂犬病毒病流行形势。

本发明的技术方案

1.一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。

2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪伪狂犬病病毒。