[发明专利]一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法。

背景技术

众所周知，遗传物质核酸大多位于细胞中，但不管是健康的人群还是患病人群，都有小部分DNA位于细胞外，称为游离核酸(cell-free DNA)。外周血中也存在游离DNA,称为外周血循环DNA(Circulating DNA in plasma)。

1987年的一篇论文中，研究人员对37例恶性肿瘤患者血浆进行了研究，其中10例标本中都分离出了游离DNA。初步鉴定的血浆游离DNA为双链，大小范围分布约为40bp-220bp。在随后的研究中，他们通过一种自己开发的体外DNA合成试验(In vitro DNA Synthesis Test)，对癌症患者血浆中的DNA的特性有了基本的判断，这种测试的基本原理是当测试反应中加入致癌剂时，肿瘤源性的DNA链稳定性会下降。到了90年代，研究人员在肿瘤患者血浆游离循环DNA上相继检测到了K-ras等基因的突变。

由于外周血游离核酸在外周血中含量稀少，上文中所述的研究人员采用的还是传统的酚氯仿抽提技术，所需要的外周血的量也比较大(需要采集50ml外周血)，试验难度可想而知。因此，如何提高提取外周血中的游离核酸的效率，成为了市面上提取试剂盒遇到的一大难题。随着科技的不断进步，市面上也陆续涌现了一些针对外周血游离核酸的提取试剂盒，可以较有效的提高核酸提取率，但都价格昂贵，成本较传统的离心柱法而言，高出50-200倍，成本问题成为了很多实验室在处理外周血游离核酸时的制约因素，因此改进传统离心柱法，提高核酸提取效率已成为当务之急。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制传统离心柱法在提取外周血游离核酸的瓶颈问题，提供一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂及其提取方法，所用试剂成分简单，操作方便，成本低廉，不需特殊设备，并能显著降低成本和提高核酸提取率。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂，其包含0.2ug/uL～5ug/uL酵母tRNA，其余部分包含超纯水；并且所述DNA提取试剂的pH值为7.3～8.2。

在一些优选实施方案之中，所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的pH值为7.5，溶剂为超纯水，溶质为如下终浓度物质：酵母tRNA 1ug/uL。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包含前述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂。

本发明实施例还提供了一种改进的离心柱法外周血游离DNA提取方法，其包括：

将待处理外周血与蛋白酶K混合，再加入第一缓冲液和所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂或试剂盒，混合均匀形成消化液，然后向所述消化液中加入无水乙醇，形成消化混合液，将所述消化混合液离心得到游离DNA。

其中，所述第一缓冲液为AL缓冲液，德国Qiagen。

在一些实施方案之中，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为5：1～20：1；所述蛋白酶K的酶活浓度范围为5mg/mL～30mg/mL。

在一些较为优选的实施方案之中，所述待处理外周血与蛋白酶K的体积比为10：1，所述蛋白酶K的酶活浓度范围为20mg/mL。

在一些实施方案之中，所述第一缓冲液与待处理外周血的体积比为0.5：1～2：1；

所述待处理外周血与所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的体积比为200：1～5000：1；

所述待处理外周血与无水乙醇的体积比为3：1～10：1。

在一些较为优选的实施方案之中，所述第一缓冲液与待处理外周血的体积比为1：1；

所述待处理外周血与所述改进的离心柱法外周血游离DNA提取试剂的体积比为1000：1；

所述待处理外周血与无水乙醇的体积比为2.5：1。

在一些实施方案之中，所述消化液的温度为50℃～65℃，消化时间为0.2h～20h。更为优选的，所述消化液的温度为56℃，消化时间为6h。

在一些实施方案之中，所述提取方法还包括：将所述消化混合液分批加入离心柱中离心，先向离心柱中加入第二缓冲液，清洗离心柱，再向离心柱中加入第三缓冲液，清洗离心柱。

其中，所述第二缓冲液为AW1缓冲液，德国Qiagen；所述第三缓冲液为AW2缓冲液，德国Qiagen。