[发明专利]基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法及应用有效
申请号: | 201710083147.5 | 申请日: | 2017-02-16 |
公开(公告)号: | CN106755519B | 公开(公告)日: | 2021-02-12 |
发明(设计)人: | 徐晓丽;汪小福;徐俊锋;彭城;陈笑芸;魏巍 | 申请(专利权)人: | 浙江省农业科学院 |
主分类号: | C12Q1/6851 | 分类号: | C12Q1/6851;C12Q1/6895 |
代理公司: | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人: | 齐云 |
地址: | 310000 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 数字 pcr 鉴定 纯合型 杂合型 转基因 玉米 12 方法 应用 | ||
1.一种基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法,其特征在于,提取待测样品的DNA进行PCR扩增,根据所述PCR扩增的荧光信号值计算所述待测样品中外源基因与内参基因的拷贝数比值,并根据所述拷贝数比值判断所述待测样品为纯合型还是杂合型转基因玉米双抗12-5;
内参基因的PCR引物序列如下:
adh1-F:5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'(SEQ ID NO.1);
adh1-R:5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'(SEQ ID NO.2);
内参基因的PCR探针序列如下:
adh1-pro:5'-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3'-BHQ1(SEQ ID NO.3);
外源基因的PCR引物序列如下:
qSK12-5F:5′-GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3′(SEQ ID NO.4);
qSK12-5R:5′-GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA-3′(SEQ ID NO.5);
外源基因的PCR探针序列如下:
qSK12-5P:5′-FAM-AGCTCAACCACATCGCCCGACGC-3'-BHQ1(SEQ ID NO.6);
根据所述拷贝数比值判断所述待测样品为纯合型还是杂合型转基因玉米双抗12-5为通过泊松分布公式计算出所述待测样品中外源基因与内参基因的拷贝数,外源基因拷贝数记为:Ne,内参基因拷贝数记为:Ni;通过Ne/Ni的值来判定样品为纯合型或杂合型,若Ne/Ni的值接近0.5,相对偏差25%,则样品为杂合型,若Ne/Ni的值接近1.0,相对偏差25%,则样品为纯合型。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述内参基因的PCR反应体系以20μL计为:
2×ddPCR Supermix for probe,10μL;引物adh1-F的终浓度为0.9μM;引物adh1-R的终浓度为0.9μM;探针adh1-pro的终浓度为0.25μM;DNA模板,2μL;总反应体系为20μL。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述PCR反应条件为:95℃预变性10min;95℃变性30sec,60℃退火及延伸45sec,共40个循环;98℃10min,4℃保存,升降温速度保持在2℃/秒。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述外源基因PCR反应体系以20μL计为:
2×ddPCR Supermix for probe,10μL;引物qSK12-5F的终浓度为0.9μM;引物qSK12-5R的终浓度为0.9μM;探针qSK12-5P的终浓度为0.25μM;DNA模板,2μL;总反应体系为20μL。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述PCR反应条件为:95℃预变性10min;95℃变性30sec,60℃退火及延伸45sec,共40个循环;98℃10min,4℃保存,升降温速度保持在2℃/秒。
6.如权利要求1所述的方法在转基因玉米双抗12-5的杂交育种及标准物质或原材料的鉴定中的应用。
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