[发明专利]基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法及应用

说明书

本发明提供了一种基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12‑5的方法及应用，该方法为提取待测样品的DNA进行PCR扩增，根据所述PCR扩增的荧光信号值计算所述待测样品中外源基因与内参基因的拷贝数比值，并根据所述拷贝数比值判断所述待测样品为纯合型还是杂合型转基因玉米双抗12‑5。该方法为转基因玉米双抗12‑5的杂交育种及标准物质或原材料的鉴定繁殖工作奠定了基础，保障材料背景的真实可靠。

技术领域

本发明涉及转基因检测技术领域，尤其是涉及一种基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法及应用。

背景技术

在采用转基因技术进行育种的过程中，首先要将目标基因导入受体植物中，一般来说，植物转化采用的受体品种都不是适宜商业化的品种，而是采用一些容易转化的品种，因此获得转基因植株后需要通过杂交的方法将转基因性状导入适宜商业化生产的品种中。在这一过程中，鉴定植物材料的纯合度是一项非常重要的工作。另外进行转基因生物及产品成分检测的一个重要的物质基础是转基因产品检测标准物质的获取，而原材料纯合度鉴定是制备标准物质的关键环节。目前对转基因植物进行纯合度鉴定通常采用的方法是将转基因植物材料进行自交或者与非转基因植株进行杂交，通过分析后代的性状分离进行鉴定，但是，这种鉴定方法需要花费大量的时间同时工作量也非常的大。

German等建立了实时荧光定量PCR的方法对转基因植物进行纯合度鉴定。实时荧光定量PCR方法有许多优势，比如快速、灵敏，但是在鉴定转基因植物的纯合度方面其精确性一直受到质疑，因为纯合性的鉴定要求能够对转基因的拷贝数达到精确区分2倍的差距的要求。采用实时荧光定量PCR的方法进行纯合度鉴定必须首先要建立标准曲线，从而确保靶标基因和内参基因反应的效率一致或非常接近。为了达到需要的精确度，要筛选优化引物，使其反应效率达到或接近100％，同时要采用高质量的定量PCR预混试剂和高质量的DNA。另外，这种方法需要一个已知纯合度的样品作为校准材料。因此，实时荧光定量PCR法通常是作为其它方法的补充。

数字PCR技术作为第三代PCR，具有不通过建立标准曲线就能够对靶标核酸进行直接定量的性能。目前有两种不同类型的数字PCR技术：微流体数字PCR和微滴数字PCR。在数字PCR中，采用微流体或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中。这样经过PCR循环之后，有核酸分子模板的反应器或微滴就会给出荧光信号，没有模板的反应器或微滴就没有荧光信号。根据相对比例和反应器或微滴的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。数字PCR具有与实时荧光定量PCR相似的快速、灵敏的优点，同时，它具有对反应抑制物较强的耐受力(Hindson et al.,2013)。两种数字PCR技术均已被用于临床诊断、单细胞基因表达和环境微生物检测等研究中，在转基因成分定量方面也多有报道，Glowacka等近期报道了采用数字PCR技术对转基因烟草进行拷贝数和纯合度分析，结果显示数字PCR技术与Southern杂交法相比具有相同的可靠性同时更加快速。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法，为转基因玉米双抗12-5的杂交育种及标准物质或原材料的鉴定繁殖工作奠定基础，保障材料背景的真实可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于数字PCR鉴定纯合型和杂合型转基因玉米双抗12-5的方法，提取待测样品的DNA进行PCR扩增，根据所述PCR扩增的荧光信号值计算所述待测样品中外源基因与内参基因的拷贝数比值，并根据所述拷贝数比值判断所述待测样品为纯合型还是杂合型转基因玉米双抗12-5。

优选地，内参基因的PCR引物序列如下：

adh1-F:5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'(SEQ ID NO.1)

adh1-R:5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'(SEQ ID NO.2)。