[发明专利]一种高效转染真核细胞的方法

说明书

本发明公开了一种高效转染真核细胞的方法，该方法包括以下步骤：（1）受体细胞的培养；（2）转染液的制备：A液：用培养基MEM稀释1~10μg浓度为10g/L的供体DNA，定量至100μL；B液：将培养基MEM定量至100μL，然后吸取2~15μg的LR加入到MEM中，室温静置15分钟；A/B复合物：将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20min；（3）转染：将配置好的Ca²⁺载体工作液加入培养好的细胞培养液中，摇匀，将所述A/B复合物缓缓加入步骤（1）所述的细胞培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，观察转染效率。本发明快速的将质粒转入真核细胞内，减少脂质体对细胞的毒性作用时间，更高效的将目的基因整合入真核细胞基因组中，减少了后期药物筛选作用时间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效转染真核细胞的方法。

背景技术

细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等。

脂质体（lipofectin regeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR而言，均先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。

因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，需要对脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等要素准确掌握。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效转染真核细胞的方法。

本发明是这样实现的，一种高效转染真核细胞的方法，该方法包括以下步骤：

（1）受体细胞的培养

在转染前一天接种待转染细胞，接种密度为2×10⁵/cm²，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO₂培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验；

（2）转染液的制备

A液：用培养基MEM稀释1~10μg 浓度为10g/L的供体DNA，定量至100μL；

B液：将培养基MEM定量至100μL，然后吸取2~15μg的LR加入到MEM中，室温静置15分钟；

A/B复合物：将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20min；

（3）转染

将配置好的Ca²⁺载体工作液加入培养好的细胞培养液中，摇匀，将所述A/B复合物缓缓加入步骤（1）所述的细胞培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，观察转染效率；其中，所述Ca²⁺载体工作液配置为：MEM、15mmol/L Hepes、0.168mg/ml NaHCO₃ 以及5μmol/LA23187。