[发明专利]一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因SV40LT插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；

B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；

C、利用DNA重组技术将自杀基因TK基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因TK基因的克隆载体，然后将所述自杀基因TK基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；

D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的CD19单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有CD19单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有CD19单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。

2.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因。

3.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，所述第二克隆载体为附加体载体pCEP4，所述第三克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato。

4.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；

当从人外周血中选择T细胞时，所述步骤B具体为：

采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理，取磁珠吸附的细胞即为富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有15～25U/mL白介素2、50-100U/mL抗CD3抗体、50-100U/mL抗CD28抗体、5％～15％胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，等细胞数量扩增到10⁶以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化T细胞；

当从人外周血中选择NK细胞时，所述步骤B具体为：

采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理，得CD3^-细胞，再通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3^-细胞中CD56⁺的细胞，获得的CD56⁺CD3^-细胞即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有15～25U/mL白介素2、5％～15％胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到10⁶以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化NK细胞。

5.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤C具体为：

选择附加体载体pCEP4，采用DNA重组技术将TK基因插入到pCEP4多克隆位点之间，构建TK的附加体表达载体pCEP4-TK，以电穿孔的方式将pCEP4-TK转入步骤B中所制备的永生化免疫细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的永生化免疫细胞，然后利用添加有潮霉素的培养基选择潮霉素抗性的细胞，即为条件自杀性免疫细胞。