[发明专利]一种用SPF鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺

权利要求书

1.本发明涉及一种用鸡胚细胞培养17D毒株生产黄热减毒活疫苗生产工艺。其特征在于：采用细胞工厂培养鸡胚细胞作为病毒培养基质细胞，接种经鸡胚细胞传代适应的17D减毒疫苗株毒种，经过培养，收集病毒液，再经过滤除菌后，加入冻干保护剂，冻干制备成品疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，本发明所用的17D减毒疫苗株毒种为世界卫生组织(WHO)提供的17D-204毒株(NIBS CODE213-77)。鸡胚细胞用SPF鸡胚制备。本发明所用的鸡胚细胞毒种为发明人经鸡胚细胞传代适应的毒种。毒种滴度按小鼠LD₅₀法滴度不低于5.60LD₅₀；蚀斑法滴定不低于5.8LgPFU/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，本疫苗细胞培养方法为：

1).胰蛋白酶消化细胞浓度0.25％，pH为7.4～7.6。

2).鸡胚细胞培养液为含5％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％NaHCO₃、2mM谷氨酰胺的MEM培养基。

3).病毒.培养液为不含牛血清的DMEM溶液，加入2％～3％NaHCO₃,pH7.4～7.6,同时补加0.5％人白蛋白。

4).鸡胚细胞培养采用细胞工厂作为培养载体，培养温度为37±0.1。

4.根据权利要求1所述的疫苗制备方法，疫苗制备采用方法：

1).病毒分种方法：采用细胞工厂培养鸡胚细胞。将消化后鸡胚细胞按2～8×10⁵/cm²细胞数接种到细胞工厂，加入细胞培养液，37±0.1℃培养，待细胞成单层后接种鸡胚细胞毒种。

培养成单层的细胞，先倒去病毒培养液，按MOI 0.01～0.5接种病毒。接种病毒后的细胞置35℃～37℃4～6小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞表面进行冲洗，最后加入pH7.4～7.6病毒培养液，送入35℃～37℃恒温室进行培养。

2)病毒混种方法为：消化后的细胞悬液按0.001～0.1MOI接种病毒充分混合后，分装至细胞工厂，置35℃～37℃培养。

培养48小时后倒去病毒培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞表面进行冲洗，最后加入病毒培养液，pH7.4～7.6，送入35℃～37℃培养。

5.根据权利要求1所述的疫苗制备方法，两种方法病毒收获时间为自接种后培养72～96小时后开始收获病毒。收获的病毒液经1μm或0.6μm滤膜澄清后再经0.22μm除菌过滤即为原液，检定合格后加入冻干保护剂进行冻干制成疫苗。

6.根据权利要求1所述的制备方法，所述的疫苗保冻干护剂溶液的成分为：不含明胶的pH7.4～7.6DMEM多糖溶液。