[发明专利]一种单克隆抗体的筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建抗体文库，并对该抗体文库进行高通量测序；

（2）获取针对目的抗原的抗体可变区基因谱；

（3）从抗体可变区基因谱中选取CDR3序列及对应的重链和轻链抗体核酸序列作为候选配对序列；

（4）分别构建重链和轻链表达载体，混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到阳性组合；

（5）将阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到的阳性组合即为与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中的混合配对方式包括如下步骤：

（a）将构建好的重链表达载体，每m条进行等量混合；

（b）将构建好的轻链表达载体，每n条进行等量混合；

（c）步骤（a）中的重链混合物分别与步骤（b）中的轻链混合物配对；

其中m、n均取大于等于1的整数。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（5）中将阳性组合中的重链和轻链进行拆分后，若原阳性组合中重链和轻链的数目均大于1，先按照1条重链与多条轻链和/或1条轻链与多条重链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，再将得到的阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到的阳性组合即为与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。

4.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）-（5）中所述的细胞转染技术依靠DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法、显微注射法、基因枪法以及电穿孔法中的任意一种或几种方法来实现。

5.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）-（5）中所述的表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物表达系统中的任意一种或几种。

6.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）-（5）中所述的活性检测方法选自ELISA、IF、PHA以及RIA中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中所述的载体构建方法选自酶切连接、同源重组中的任意一种或几种。

8.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中所述的混合方式是重链表达载体与轻链表达载体以一定的质量比进行混合，混合的比例可以根据重链和轻链的条数进行相应调整。

9.根据权利要求1-3任一所述的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中所述选择CDR3序列的原则为：选择CDR3聚类后的高频序列、免疫后或爆发期比与免疫前或恢复期出现频率有明显提升的CDR3序列或CDR3对应的V基因家族在免疫后或爆发期较免疫前或恢复期存在明显差异的序列中的任意一种或几种。

10.根据权利要求1-9任一所述单克隆抗体的筛选方法在生物学、免疫学、医学以及相关领域中的应用。