[发明专利]一种单克隆抗体的筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体的筛选方法，包括：（1）混合筛选，m条抗体重链表达载体和n条抗体轻链表达载体混合进行体外抗体表达，ELISA鉴定得到阳性组合；（2）拆分筛选，若（1）得到的阳性组合中重链和轻链的数目均大于1，先按照1条重链与多条轻链和/或1条轻链与多条重链的原则配对，进行体外抗体表达，利用ELISA鉴定得到阳性组合；（3）将阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，进行体外抗体表达，ELISA检测呈阳性的配对组合即为能产生功能性的单克隆抗体的重/轻链组合。本发明的筛选方法简单高效、切实可行，筛选获得的单克隆抗体具有特异性和较高的亲和性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单克隆抗体的筛选方法及其应用。

背景技术

抗体是指抗原刺激机体后，由B淋巴细胞或浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。其中，由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体，简称单抗。它具有特异性强、纯度高、均一性好等优点。第一代单抗由Kohler和Milstein在1975年制备，它是来源于小鼠B细胞杂交瘤的抗绵羊红细胞的单克隆抗体。现如今，随着单克隆抗体制备技术的不断发展和完善，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等多种学科和领域得到了广泛的应用，同时也对于生物学分子机理的研究也起到了很大的推动作用。近年来，随着研究的不断深入，越来越多的单克隆抗体药物被发掘并应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是在肿瘤免疫治疗中显示出良好的前景。

单克隆抗体的获得虽然让人们发现了新的领域，但是它在临床上的应用却经历了漫长的过程，主要原因是传统的杂交瘤技术所生产的抗体是鼠源性的，而鼠源单抗在疾病治疗中存在诸多问题，例如：鼠源单抗在人体中常常不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统；易被人类免疫系统识别，产生人抗鼠抗体反应；且在人体循环系统中很容易被清除。随着研究的不断深入，又产生了诸如嵌合抗体，噬菌体展示为代表的体外展示技术，单细胞克隆技术，EB病毒介导的B细胞永生技术，蛋白质谱分析结合DNA高通量测序技术等等单克隆抗体制备技术，这些技术在保留对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化的改造，大大减少异源抗体的免疫源性，但是这些技术也存在着缺点，比如单克隆抗体产量不稳定，易于丢失。体外展示技术也需要较长的周期并且产生的抗体与杂交瘤抗体相同均需要后续进行人源化等。

二代测序技术(NGS)是近年来发展起来的费用低、通量高、速度快的 DNA 测序技术。同时，这一新兴的技术领域已经发展成为发掘功能性抗体的一种重要手段，随着其发展，抗体组学研究经历了从低通量到高通量的时代变革，使得抗体库技术也在抗体工程领域取得重大进展，一次二代测序即可获得数以百万计的 B细胞的抗体CDR3序列，通过比较免疫前后宿主抗体基因谱中CDR3序列的频率，揭示特定免疫状态下抗体基因谱中特异性抗体丰度的变化，挑选频率变化最大的CDR3序列挑出全长序列，作为特异性抗体的候选序列在体外配对表达进行功能验证。该方法为人们展示了更广阔的抗体谱特性，且不限物种，可以在短时间内从抗体基因谱中产生大量的候选配对，最终通过功能验证便可能得到具有高亲和力的抗体。

二代测序的应用使抗体库技术得到迅速发展，且已经广泛用于研究抗体基因谱组成的多样性，通过高通量测序，我们可以得到众多重链和轻链的序列，如何在众多的序列中快速找到与抗原具有亲和力的重链和轻链配对一直是一个难题。传统的方法是分别构建重链和轻链的表达载体，然后按照单一重链和单一轻链组合的原则，进行表达以及功能性验证。虽然采用传统的筛选系统对于获得高水平表达的细胞克隆具有一定优势，但是它却存在耗时长、工作量大和难以大规模进行筛选等缺点，因此寻找一种高通量的抗体筛选方式显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体的筛选方法，该方法能够从NGS得到的大量序列中快速找出能产生对抗目的抗原的单克隆抗体的重链和轻链配对组合，从而获得大量高产量，高特异性的重组抗体蛋白，省时省力，能显著提高工作效率。