[发明专利]一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物及应用该引物进行桑椹菌核病鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC‑18S‑F和下游引物CC‑18S‑R组成，所述上游引物CC‑18S‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物CC‑18S‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本发明还公开了一种应用该特异性引物鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的方法，该方法在桑椹菌核病的发病早期即能快速鉴定桑椹菌核病。

技术领域

本发明属于菌核病技术领域，具体涉及一种由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病鉴定的特异性引物及其应用。

背景技术

桑椹菌核病又称白果病，是桑椹的主要病害，该病由真菌引起，病菌在桑椹开花时开始侵入。健康的桑椹成熟时呈紫红色，受桑实杯盘菌侵染的桑椹变白色或灰白色，花被显著肥大。病椹落地后，花被部分脱离变成黑色菌核。随着桑椹种植面积的不断扩大，桑椹菌核病持续大面积爆发，且呈蔓延趋势，严重果园甚至颗粒无收，极大地影响种植户的经济效益，威胁着桑椹产业的发展。桑椹菌核病的病原菌主要有4种，分别为核盘菌、桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌和核地杖菌。经研究，广东地区的桑椹菌核病病原菌主要为肉阜状杯盘菌。

目前，鉴定桑椹菌核病的主要方法是表型鉴定。表型鉴定即通过观测桑椹的发病表型特征来判定桑椹菌核病是否发生。由于植株病症表型在发病中后期才能观测到，而病原菌在桑椹开花时即已侵入体内，因此表型鉴定方法对桑椹菌核病的防控意义不大。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定桑椹菌核病的特异性引物，应用该引物可进行由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的检测。

本发明的第二个目的在于提供一种应用该特异性引物鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的方法，该方法在桑椹菌核病的发病早期即能快速鉴定桑椹菌核病。

本发明的第三个目的在于提供上述桑椹菌核病鉴定的特异性引物在制备具有鉴定桑椹菌核病功能的药物中的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于鉴定由肉阜状杯盘菌引起的桑椹菌核病的特异性引物，其特征在于：由上游引物CC-18S-F和下游引物CC-18S-R组成，所述上游引物CC-18S-F的核苷酸序列如SEQID NO：1中所示，所述下游引物CC-18S-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。

根据NCBI数据库中桑椹肉阜状杯盘菌的18SrRNA(GenBank ID：KY449059)序列特征，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0设计和筛选了上述肉阜状杯盘菌的荧光PCR特异性引物(CC-18S-F:GAGTGAGCATAAGCTCACCCCGA，如SEQ ID NO：1中所示；CC-18S-R:CTCCACCCCCCGAGAGCGGTC，如SEQ ID NO：2中所示)。该引物对理论扩增片段大小为344bp，该引物可由华大基因等公司合成。

本发明的特异性引物可用于常规PCR和荧光定量qPCR。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种应用上述的特异性引物进行桑椹菌核病的鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取发病桑椹和健康桑椹各10个，提取这些桑椹的DNA；

(2)以提取的所述发病桑椹和健康桑椹的DNA为模板，利用上述肉阜状杯盘菌的特异性引物进行荧光定量qPCR；记录发病桑椹和健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值；将测得的所有所述健康桑椹DNA的qPCR反应体系的Ct值中的最小值作为评判该桑椹是否具有桑椹菌核病的临界值；

(3)取待检测的桑椹，并提取该桑椹的DNA；