[发明专利]一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体包括CMV启动子、FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、SV40PolyA结构、RLuc表达框、HSV-TK启动子、大肠杆菌启动子、SV40启动子、SV40复制起点、Kan/Neo抗性基因、用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点和HSV-TK PolyA结构；所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体还包括用以增强RLuc表达的嵌合人β-球蛋白内含子、f1单链DNA复制起点、pUC质粒复制起点。

2.根据权利要求1所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.权利要求1-2中任意一项所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)先以pGL3-Basic载体为模板，采用PCR方法扩增制备出FLuc片段，然后采用定向克隆法将制备的FLuc片段替换pEGFP-C1质粒中的EGFP片段，构建成为pFLuc-C质粒；

2)以pRL/TK载体为模板，采用PCR方法扩增制备出RLuc表达框，再以同源重组的方法将RLuc表达框插入pFLuc-C质粒中，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc载体；

3)以pFLuc-C-TK-RLuc载体为模板，采用PCR方法在该载体的Kan/Neo抗性基因终止码后引入用于插入待筛选的shRNA的多克隆位点，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体，即为用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体。

4.根据权利要求3所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中PCR过程中使用的引物为P1和P2，获得的FLuc片段中含有NheI和XhoI酶切位点，其中引物P1和P2具体如下：

P1：5 '-ggggctagcgtcgaccgccac cat ggaagacgccaaaaa cat aaa g-3 '；

P2：5 '-tttctc gag ccttctgttgggttaagaagtcgattacacggc gat ctttccgccctt c-3'。

5.根据权利要求3所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR过程中使用的引物为P3和P4，获得的RLuc表达框含有与pFLuc-C质粒进行重组反应的短臂，其中引物P3和P4具体如下：

P3：5 '-caatttacgccttaaagatctaaatgagtcttcggacct c-3 '；

P4：5 '-atcaatgtatcttaatcatgtctgctcgaagcggccgct c-3 '。

6.根据权利要求3所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR过程中使用的引物为P5和P6，步骤3)中经PCR获得的扩增产物的5'端含有PacI和EcoRI酶切位点，3 '端含有XhoI和PacI酶切位点，该扩增产物经PacI酶切后，连接成环，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体，其中引物P5和P6具体如下：

P5：5 '-aaattaattaaactagtgcgggactctggggttcgaaatgaccga c-3 '；

P6：5 '-aaattaattaagatatct cag aagaactcgtcaagaaggcga tag aag-3 '。

7.权利要求1-2中任意一项所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体在双萤光素酶报告基因检测方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体用于代替双萤光素酶报告基因检测系统中的三个载体，所述三个载体分别为将靶基因构建至FLuc基因3 '非翻译区的报告基因载体、产生待筛选shRNA的真核表达载体以及表达RLuc的内参载体。